曾德貴 陳保安 吳尚 黃慧 伍俊

[摘要] 目的 探討柚皮素對人肺鱗癌細胞NCI-H2170的增殖、凋亡及細胞周期的影響。 方法 用MTT法檢測柚皮素對NCI-H2170細胞增殖的影響，Hoechst33258/PI染色檢測NCI-H2170細胞形態(tài)學變化，流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞周期的改變。Western blot檢測柚皮素處理NCI-H2170細胞24 h后PARP、Bcl-2、Bid、procaspase-3及procaspase-8蛋白的表達。 結(jié)果 柚皮素處理人肺鱗癌NCI-H2170細胞24 h后，濃度依賴性地抑制NCI-H2170細胞增殖；其中12.5 μmol/L處理組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學（P > 0.05）；25、50、100 μmol/L處理組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。流式細胞儀分析結(jié)果顯示：不同濃度的柚皮素處理NCI-H2170細胞24 h后，與對照組比較，12.5 μmol/L處理組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；25、50、100 μmol/L處理組G1期細胞顯著增多，S期及G2期細胞顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。25、50、100 μmol/L處理組與對照組相比，柚皮素上調(diào)Bid表達，促進PARP降解，Bcl-2、procaspase-3和procaspase-8降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 柚皮素抑制人肺鱗癌NCI-H2170細胞增殖，并能誘導(dǎo)NCI-H2170細胞產(chǎn)生G1期阻滯，誘導(dǎo)細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 柚皮素；人肺鱗癌NCI-H2170細胞；細胞凋亡；增殖；細胞周期

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（b）-0004-05

Effects of Naringenin on the proliferation and apoptosis of lung cancer cell NCI-H2170

ZENG Degui1* CHEN Bao′an2* WU Shang3 HUANG Hui3 WU jun1，2

1.Department of Pharmacy， Shenzhen Center for Chronic Disease Prevention and Control， Guangdong Province， Shenzhen 518020， China； 2.Institute of Respiratory Diseases， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang 524023， China； 3.Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guangdong Medical University， Zhanjiang ， Guangdong 524023， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Naringenin on the proliferation， apoptosis and cell cycle of human lung squamous cell carcinoma cell line NCI-H2170. Methods The proliferation of NCI-H2170 cells was detected by MTT assay. The morphological changes of NCI-H2170 cells were detected by Hoechst33258/PI staining. Cell cycle changes were measured by flow cytometry （FCM）. Western blot was used to detect the expression of PARP， Bid， Bcl-2， procaspase-3 and procaspase-8 in NCI-H2170 cells treated with naringenin. Results The proliferation of human lung squamous cell carcinoma NCI-H2170 cells were inhibited in a dose-dependent manner after treating with Naringenin for 24 h. It was not significant difference between 12.5 μmol/L treatment group and the control group （P > 0.05）.However， 25， 50， 100 μmol/L treatment groups were significantly different comparing to the control group （P < 0.05）. The results of flow cytometry analysis showed that it was not significant difference between 12.5 μmol/L treatment group and the control group （P > 0.05）. However， after NCI-H2170 cells were treated with 25， 50， 100 μmol/L naringenins， the number of cells had significantly increased in G1 phase， desceased in S phase and G2 phase， comparing to the control group （P < 0.05）. Naringenin up-regulated Bid expression， promoted the degradation of PARP and the decrease of Bcl-2， proaspase-3 and proaspase-8 in NCI-H2170 cells， comparing to the control group （P < 0.05）. Conclusion Naringenin inhibits the proliferation of human lung squamous cell carcinoma cell line NCI-H2170 and induces the G1 phase arrest in NCI-H2170 cells and induces cell apoptosis.

[Key words] Naringenin； Human lung cancer cell line NCI-H2170； Apoptosis； Proliferation； Cell cycle

肺鱗癌占原發(fā)性肺癌的40%～51%，肺鱗癌與吸煙有密切關(guān)系，嚴重危害人體健康和生命[1]。目前針對肺鱗癌治療方法有手術(shù)、放療、化療治療等。手術(shù)、放療、化療的毒副作用對人體的巨大傷害，使機體自身的抗病能力大大降低，容易引起腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移[2]，所以篩選效果佳，低毒的抑癌藥物特別重要。從天然藥物中篩選治療肺鱗癌是目前藥物研發(fā)方向之一。柚皮素是一種天然黃酮類化合物，其廣泛存在于檸檬、葡萄汁、橘子等中，具有多種生物學活性和藥理作用[3-4]。Park等[5]研究提示，柚皮素抑制胰腺癌過氧化物氧還蛋白-1（Peroxiredoxin-1，Prdx-1）的表達，促進凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）的上調(diào)，誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生介導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡。柚皮素通過干預(yù)PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡[6]；抑制乳腺癌細胞分泌TGF-β1，并減弱PKC活性阻止乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[7]。本研究擬從柚皮素影響肺鱗癌細胞的增殖、阻滯細胞周期和關(guān)鍵凋亡蛋白表達變化方面進行研究，并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

NCI-H2170細胞株以含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃，5%CO2中培養(yǎng)。RPMI1640（Gibco公司，批號：C11875500BT）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20160718）；Western blot luminol reagent（北京中杉金橋生物有限公司）；兔抗山羊IgG-HRP，山羊抗鼠IgG-HRP，山羊抗人Bid（sc-6538），procaspase-3（sc-1225），procaspase-8（sc-73526）和PARP（sc-1561）抗體（均為Santa Cruz公司產(chǎn)品）。Hoechst33258/PI染色溶液（江蘇碧云天，批號：40730ES10）和PI（上海源葉生物科技有限公司，批號：S19136）。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測細胞生長增殖情況 取處于對數(shù)生長狀態(tài)的NCI-H2170細胞，胰酶消化分散細胞，計數(shù)，按照每孔5×103個細胞加入96孔板中，100 μL/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換含不同濃度柚皮素的RPMI1640培養(yǎng)液，每個柚皮素濃度設(shè)5個復(fù)孔，柚皮素濃度分別為0、12.5、25、50、100 μmol/L，其中對照組柚皮素濃度是0 μmol/L。柚皮素處理24 h后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），再培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，混勻5～10 min，待沉淀完全溶解后，選擇波長570 nm，用酶標儀測每孔OD值，按公式計算細胞存活率：細胞存活率=（加藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100%，并重復(fù)3次實驗。

1.2.2 Hoechst33258/PI染色觀察NCI-H2170細胞的凋亡 取處于對數(shù)生長狀態(tài)的NCI-H2170細胞，用胰酶消化分散細胞，計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為1.0×106個/mL，向六孔板的每個孔內(nèi)加入2 mL細胞懸液。靜候細胞完全貼壁后（為50%～80%滿），更換含不同濃度柚皮素的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液含柚皮素藥物分別為0、12.5、25、50、100 μmol/L，其中對照組柚皮素濃度是0 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每孔胞內(nèi)添加Hoechst33258/PI溶液，37℃反應(yīng)10 min。用熒光顯微鏡在激發(fā)光350 nm，發(fā)射光在460 nm條件下觀察拍照，熒光顯微鏡下活細胞核呈均勻彌散的藍色熒光，凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)致密濃染的熒光顆粒。

1.2.3 用流式細胞技術(shù)分析細胞周期 加入不同柚皮素濃度（0、12.5、25、50、100 μmol/L）作用1.0×106個/mL NCI-H2170細胞后，1000 r/m，r=5 cm，離心5 min沉淀細胞。PBS漂洗后，加入預(yù)冷的70%的乙醇溶液懸浮細胞，4℃固定過夜。檢測前用1000 r/m，r=5 cm，離心5 min，倒掉乙醇溶液，然后用PBS洗3次，加入0.5 mL 50 μg/mL PI染液避光染色30 min。用100目的尼龍膜過濾細胞，然后用流式細胞儀檢測細胞DNA的含量，計算各周期時相細胞的百分比。

1.2.4 免疫印跡 不同濃度柚皮素（0、25、50、100 μmol/L，12.5 μmol/L與25 μmol/L效果相差不大，因而在免疫印跡分析時將12.5 μmol/L組放棄）作用1.0×106個/mL NCI-H2170細胞24 h后，收集細胞，用PBS洗滌細胞后加入細胞裂解液100 μL（50 mmol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液，含150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，2 μg/mL Aprotinin，0.5 μg/mL Leupeptin，1%NP40， 0.05%PMSF），在冰上用超聲波破碎細胞，10 s/次，共3次，每次間隔10 s。12 000 g，離心5 min，去細胞裂解上清液。取10 μL上清液用考瑪斯亮蘭G-250染色法測定各組裂解液蛋白含量，其余上清液，按1∶1體積加入2倍濃度的上樣緩沖液（100 mmol/L pH6.8 Tris-HCl，4%SDS，20%甘油，10% β-巰基乙醇，0.05 mg/mL溴酚蘭）。

進行電泳前煮沸樣品5 min，每個電泳泳道加蛋白量為100 μg，進行SDS-PAGE電泳，然后低溫環(huán)境進行電轉(zhuǎn)。將轉(zhuǎn)移好的NC膜在含5%（W/V）脫脂奶粉磷酸鹽緩沖液中封閉液2 h。一抗加入量按0.1 mL/cm2，在室溫用搖床平緩搖動反應(yīng)2 h。用TBS（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L tris-HCl，pH7.5）洗滌3次，每次15 min。按0.1 mL/cm2的量加入二抗，室溫在平緩搖動的搖床反應(yīng)2 h。用TBS（150 mmol/L NaCl， 50 mmol/L tris-HCl，pH7.5）洗滌3次，每次15 min。在暗室中，將ECL試劑的A、B液在一小平皿中等量混合，按0.13 mL/cm2的量加于NC膜上，數(shù)碼成像保存。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，先用Homogeneity of Variances進行方差齊性檢驗，方差齊性用LSD-t檢驗，方差不齊用Tamhane′s T2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素抑制NCI-H2170細胞生長

NCI-H2170細胞被不同濃度的柚皮素處理24 h后，用MTT法測定藥物對細胞生長的影響，結(jié)果顯示，柚皮素濃度依賴性地抑制NCI-H2170細胞增殖；其中12.5 μmol/L處理組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；而25、50、100 μmol/L處理組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 Hoechst33258/PI熒光染色結(jié)果

在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)活細胞的細胞核染被均勻地染成淡藍色熒光，而凋亡細胞的胞核呈現(xiàn)出亮藍色，有的核呈分葉狀凝聚。細胞經(jīng)柚皮素處理后，對照組細胞核染被染成均一的淡藍色，12.5 μmol/L處理組細胞核大多染為淡藍色，出現(xiàn)少數(shù)亮藍色染色，這種現(xiàn)象在25 μmol/L處理組中進一步增加。50 μmol/L處理組細胞數(shù)目較少，細胞核大多呈現(xiàn)出典型的凋亡核形態(tài)的特征：藍色熒光增強，細胞核壓縮碎裂成大小不一的不規(guī)則塊狀、圓形或花瓣狀。柚皮素100 μmol/L處理組細胞減少，亮藍色體積偏小的凋亡小體的比率增加。見圖2（封四）。

2.3 柚皮素作用24 h對NCI-H2170細胞周期的影響

NCI-H2170細胞被不同濃度的柚皮素處理24 h后，收集各組細胞用流式細胞儀檢測。與對照組相比，12.5 μmol/L處理組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；25、50、100 μmol/L處理組G1期細胞增多，S期及G2期細胞減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 Western blot檢測分析凋亡相關(guān)蛋白表達

25、50、100 μmol/L處理組與對照組相比較，柚皮素上調(diào)Bid蛋白水平，促進PARP蛋白水平下降，Bcl-2蛋白水平下降；procaspase-3和procaspase-8蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

肺鱗癌對放療、化療存在一定耐受性，尋找有效的副作用低的天然藥物有效單體是目前研究的熱點，也是實現(xiàn)中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化的方向[9]。本研究選擇了黃酮類化合物柚皮素，柚皮素作為一種中藥成分，其來源廣泛，價格低廉，具有廣泛的生理及藥理活性等優(yōu)點，正逐漸成為醫(yī)藥和保健領(lǐng)域研究的熱點。本次實驗研究了柚皮素對肺鱗癌NCI-H2170細胞生長、細胞凋亡及細胞周期等方面的影響。

細胞增殖和細胞凋亡受細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，細胞生長有賴于細胞增殖和細胞凋亡的平衡。研究抗癌物質(zhì)對細胞增殖的影響常常是驗證其抗癌有效性的一種重要手段[8]。中藥毒副作用小，也可減輕放化療引起的毒副作用，增強放化療的敏感性[9]。本研究結(jié)果提示柚皮素抑制肺鱗癌細胞增殖生長，抑制效果與柚皮素的濃度相關(guān)。用熒光染料染色觀察發(fā)現(xiàn)，柚皮素誘導(dǎo)肺鱗癌細胞凋亡，這與Banjerdpongchai等[10]在肝癌中的研究結(jié)果類似，提示柚皮素通過誘導(dǎo)肺鱗癌細胞凋亡抑制了細胞增殖。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，通常被分為四期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。增殖細胞的染色體在S 期復(fù)制，經(jīng)過G2期后，細胞開始有絲分裂的復(fù)雜過程。腫瘤呈快速生長狀態(tài)，一般S期細胞比例比正常生長細胞高。碘化丙啶（PI）與DNA緊密結(jié)合，用流式細胞術(shù)檢測細胞結(jié)合PI熒光強度和數(shù)量可檢測分析細胞周期分布情況。本研究結(jié)果提示，柚皮素可以使NCI-H2170細胞G1期比例增加，S期及G2期比例減少，說明柚皮素作用NCI-H2170細胞24 h，抑制了肺鱗癌DNA復(fù)制，使細胞周期阻滯于G1期，抑制細胞快速增殖[11]。許多腫瘤的發(fā)生與細胞周期的失控有關(guān)，對細胞周期進行干預(yù)也是目前腫瘤治療的一個方向[12-13]。

細胞凋亡的機制十分復(fù)雜，Caspase家族與細胞凋亡關(guān)系密切[14-15]。它們均以無活性的前體存在于細胞中，一經(jīng)激活，將產(chǎn)生Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡。Bid屬于促凋亡BH3-only亞家族，Bid表達水平增加可拮抗Bcl-2的作用，并促進細胞凋亡[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)柚皮素作用于肺癌NCI-H2170細胞后，Bid表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)；同時發(fā)現(xiàn)柚皮素誘導(dǎo)procaspase-3、procaspase-8水平下降，表明procaspase-3、procaspase-8激活[15]。可見Bid、Caspase-3、Caspase-8參與了柚皮素誘導(dǎo)肺癌NCI-H2170細胞凋亡的過程。

PARP廣泛存在于真核細胞核內(nèi)，具有蛋白質(zhì)修飾和核苷酸聚合作用，參與染色質(zhì)解聚，DNA復(fù)制及修復(fù)。細胞內(nèi)含有豐富的完整的PARP可抵抗化療藥物對細胞的損傷。如果PARP被切割降解失活，則會使得細胞喪失DNA損傷修復(fù)的功能促進細胞凋亡[14-15]。在本研究中，柚皮素處理NCI-H2170細胞24 h后，PARP蛋白表達量下降，切割增加?？梢婅制に乜纱龠MPARP切割降解，使肺鱗癌細胞不能及時修復(fù)受損的DNA，抑制DNA復(fù)制。最終促進肺鱗癌細胞凋亡。

研究表明柚皮素對肺鱗癌NCI-H2170細胞生長凋亡的調(diào)控與Bid、Caspase-3、Caspase-8和PARP蛋白參與的信號途徑有關(guān)。筆者將進一步深入展開研究柚皮素和順鉑是否具有協(xié)同作用抑制肺鱗癌的生長，并進一步研究柚皮素的分子藥理機制。

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（收稿日期：2018-01-10 本文編輯：李岳澤）