田宇 毛於安

[摘要] 目的 探討慢傳輸型便秘（STC）大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞（ICCs）自噬現(xiàn)象的發(fā)生情況，并定性分析其鈣離子濃度水平的變化。 方法 選用SPF級健康Wistar雄性大鼠40只，按照隨機數(shù)字表法分為對照組（n=20，正常大鼠）和模型組（n=20，造模大鼠）。采用復(fù)方苯乙哌啶制備STC大鼠模型，記錄大鼠糞便粒數(shù)、每粒糞便質(zhì)量、大鼠體重及首粒黑便排出時間的變化，判定模型成功建立與否。免疫熒光檢測兩組大鼠結(jié)腸ICCs形態(tài)變化，透射電鏡檢測結(jié)腸ICCs自噬情況，免疫熒光法測定ICCs中的鈣離子濃度。 結(jié)果 對照組大鼠試驗期間均生長良好，模型組1例死亡。模型組大鼠日均糞便粒數(shù)及造模第30天模型組平均體質(zhì)量較對照組明顯減少（P < 0.05），平均每粒糞便質(zhì)量較對照組升高（P < 0.05），首次排黑便時間較對照組明顯延長（P < 0.05）。對照組大鼠結(jié)腸組織中的ICCs細胞相互交織相連形成了密集且精密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，存在條形分支。模型組大鼠腸道內(nèi)ICCs細胞數(shù)量明顯減少，ICCs交互網(wǎng)絡(luò)稀薄，細胞變窄變細。與對照組比較，模型組中ICCs細胞自噬泡數(shù)量上升且表現(xiàn)出明顯細胞自噬性死亡。對照組大鼠中ICCs細胞胞體平滑且細胞分叉，細胞間連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。STC大鼠ICCs中熒光斑點數(shù)量及熒光強度與對照組比較，明顯升高。 結(jié)論 STC大鼠腸道內(nèi)ICCs的數(shù)量減少是發(fā)生了細胞自噬現(xiàn)象。STC大鼠模型中ICCs細胞內(nèi)游離Ca2+升高，Ca2+升高可能是導(dǎo)致ICCs自噬性死亡的原因。

[關(guān)鍵詞] 慢傳輸型便秘；結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞；自噬現(xiàn)象；大鼠；鈣離子濃度

[中圖分類號] R574 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（b）-0020-04

Autophagy of Cajal mesenchymal cells in the colon Cajal in rats with slow transit constipation and the qualitative analysis of calcium ion level

TIAN Yu MAO Yu′an

Department of Digestive Medicine， the Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830002， China

[Abstract] Objective To investigate the autophagy of Cajal mesenchymal cells in the colon Cajal in rats with slow transit constipation， and qualitatively analyze the calcium ion level. Methods Forty healthy Wistar male rats were divided into control group （n=20， normal rats） and model group （n=20， model rats） by random number table. Compound phenylethylpiperidine was used for preparation on STC rat model， grain number， every grain of waste quality， body quality of rats， the first grain of black were recorded to judge the model successfully established or not. Colon ICCs of rats in two groups were detected bydetection of immunofluorescence assay， and the concentration of calcium ions in ICCs was determined by immunofluorescence assay. Results The control group had good growth during the experiment， and one died in the model group. Daily waste grain number， average body quality after 30 days in model group were less than those in the control group（P < 0.01）， the average grain of feces quality was higher than that in the control group （P < 0.05）， and the first row of black time was obviously prolonged in the control group （P < 0.05）. The rats colon tissue of ICCs in control group were intertwined to form the intensive and precision of the mesh structure， they had obvious cell branch. The number of ICCs in the intestinal tract of the model group was significantly reduced， and the ICCs was thin and the cell shape narrowed. Compared with the control group， the autophagy number of ICCs in the model group increased and showed the apparent autophagy death. In the control group， ICCs were smooth and had multiple directional and irregular cell branches， and intercellular interaction was connected to the network structure. The number of fluorescence spots and fluorescence intensity in the ICCs of STC rats were significantly higher than those in the control group. Conclusion The number of ICCs in STC rats is reduced and autophagy is occurred. In the STC rat model， the free Ca2+ ions in the ICCs cells are elevated， and the increasing of Ca2+ ion may be the cause of the ICCs′ autophagy death.

[Key words] Slow transit constipation； Colon Cajal mesenchymal cells； Autophagy phenomenon； Rats； Ca2+ ion concentration

慢傳輸型便秘（STC）是一種涉及全胃腸道動力紊亂而引發(fā)的腸內(nèi)容物在結(jié)腸近端到結(jié)直腸遠端的通過時間較正常情況有所減慢而引發(fā)的疾病，STC占功能性便秘患者的45.5%左右[1-3]，且臨床表現(xiàn)較為頑固，嚴重影響患者的生活質(zhì)量、身心健康[4]。動物實驗表明，慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞無法正常發(fā)揮功能，通過免疫熒光檢測模型及正常大鼠結(jié)腸ICCs形態(tài)變化推測可能發(fā)生自噬[5]。細胞自噬被認為是在正常情況下當細胞面對外界的異常能量代謝、營養(yǎng)不良等的一種自我應(yīng)激反應(yīng)。誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬的因素緣于細胞外，也有可能是來自細胞內(nèi)的因素[6-7]。利用透射電鏡檢測結(jié)腸ICCs自噬現(xiàn)象，并用鈣離子水平的定性分析來進一步驗證，目前較少有此思路的研究。因此，本研究采用藥物造模法，明確STC中ICCs功能異常的原因，為利用STC的發(fā)病機制來指導(dǎo)臨床治療提供價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar健康大鼠40只，雄性，SPF級，8周齡，體重（120±10）g，由我院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK-（冀）2007-004，實驗動物合格證號：1131800645；按隨機數(shù)字表法分為對照組（n=20）和模型組（n=20）。室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（室溫18～24℃，相對濕度50%～70%，每天光照10～12 h，自由飲水）。

1.2 試劑與儀器

復(fù)方苯乙哌啶，由河南中孚藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20170911，產(chǎn)品規(guī)格：2.5 mg（鹽酸地芬諾酯）-25 μg（硫酸阿托品）；活性炭懸液（100 g/L），粉末活性炭（分析純）；c-kit兔抗鼠多克隆抗體（Sigma公司，美國）；DAB顯色試劑盒、3%過氧化氫溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

CX22生物顯微鏡（日本奧林巴斯）；RM2235組織切片機（德國徠卡）等。

1.3 STC大鼠模型的建立及鑒定

1.3.1 STC大鼠模型的建立 大鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后建模，模型組大鼠予含復(fù)方苯乙哌啶的混懸液灌胃，劑量8 mg/（kg·d），對照組灌胃同體積的生理鹽水。飼養(yǎng)時間為30 d，飲水不限。

1.3.2 STC大鼠模型的鑒定 采用首粒黑便排出時間來評價腸道傳輸功能，進而判定模型成功與否。取100 g阿拉伯樹膠放入燒杯中，加入雙蒸純水至800 mL，煮沸，肉眼觀察呈透明狀后停止加熱，再加入40 g純凈的活性炭煮至透明，4℃保存?zhèn)溆谩Ｄ┐螐?fù)方苯乙哌啶灌胃大鼠，后將其全部禁食不禁水8 h。禁食結(jié)束分別對兩組大鼠灌入5 mL上述備用懸液。以灌胃結(jié)束為起始點計時。統(tǒng)計每組大鼠糞便粒數(shù)、糞便質(zhì)量、第7天及第30天體質(zhì)量、第1次排出黑便的時間。

1.4 觀察指標

1.4.1 免疫熒光檢測大鼠結(jié)腸ICCs變化 3%戊巴比妥麻醉兩組大鼠后處死，剪開腹腔，并常溫0.01 mol/L PBS清洗其內(nèi)腔以維持內(nèi)腔的濕潤。用小剪在整段腸道距盲部腸3～5 cm處取整段結(jié)腸，用細線結(jié)扎一端，另一段灌注4%多聚甲醛并保持溶液充盈，后將結(jié)腸另一端扎緊，固定液中固定8～12 h，分層鋪片，0.01 mol/L PBS漂洗，解剖顯微鏡下展開上述標本并沿腸系膜的邊緣緩慢剪開，剝離腸道內(nèi)部及周圍黏膜，取出黏膜下環(huán)行平滑肌層及縱行平滑肌，剪成標本塊并放入0.01 mol/L PBS漂洗，1%BSA孵育0.5 h，繼續(xù)0.01 mol/L PBS漂洗樣本，后滴加0.2% BSA+0.02 mol/L PBS配制的一抗（大鼠抗小鼠的c-Kit抗體，1∶100），室溫放置2 h后4℃孵育48 h。滴加0.2% BSA/0.01 mol/L PBS稀釋二抗兔抗大鼠抗體（1∶1000），室溫避光孵育90 min。漂洗、復(fù)染、封片，暗處常溫保存。顯微鏡下觀察，免疫熒光染色鋪片每只動物3張。對照組以對照物大鼠血清進行相同的實驗操作。

1.4.2 透射電子顯微鏡檢測結(jié)腸ICCs變化 取部分結(jié)腸組織0.9% Nacl沖洗，切成小塊，固定液固定24 h。后用0.1 mol/L PBS漂洗5min，洗3次。于1%鋨酸0.1 mol/L的PBS溶液中避光固定2 h。雙蒸水漂洗，每次5 min，共計3次。并于飽和醋酸鈾水溶液中室溫避光染色處理1～2 h，乙醇溶液梯度洗脫（50%、70%、80%、90%、100%），每次10 min。100%乙醇+66%環(huán)氧丙烷混合液及100%環(huán)氧丙烷分別處理10min，1∶1和1∶4的環(huán)氧丙烷與包埋劑浸標本分別40 min及3 h，37℃過夜12 h。解剖顯微鏡下削去包埋劑，露出組織標本。玻璃刀切片，厚度0.2 μm左右。將切片置于載玻片上，滴加雙蒸水，至90℃。1%甲苯胺蘭染色，透射電子顯微鏡（TEM）觀察大鼠結(jié)腸組織中ICCs形態(tài)變化，并統(tǒng)計細胞內(nèi)自噬體數(shù)量。

1.4.3 免疫熒光法檢測STC大鼠ICCs中的鈣離子濃度 依次剝離大鼠結(jié)腸段內(nèi)黏膜以及黏膜下層，注意保留結(jié)腸肌肉層，無鈣PBS緩沖液反復(fù)沖洗，1200 r/min，r=0.5 μm，離心10 min棄上清，150目分子篩過濾，濾液加入0.25% NaCl 5 mL混勻，立即加入3mL 2% NaCl，混勻后1500 r/min，r=0.5 μm，離心3 min，棄上清，反復(fù)3次，收集細胞懸浮，調(diào)整濃度為5×105/mL。恒溫細胞培養(yǎng)箱中孵育0.5 h，500 r/min離心5 min，棄上清。純無鈣緩沖液反復(fù)洗滌后稀釋到1 mL。480 nm波長下觀察細胞熒光強度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般狀況的變化比較

對照組大鼠試驗期間均生長良好，模型組1例在造模后第3天死亡。模型組大鼠日均糞便粒數(shù)比對照組明顯縮?。≒ < 0.05）；平均每粒糞便質(zhì)量較對照組明顯增大（P < 0.05）；造模第7天兩組的平均體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而造模第30天模型組較對照組明顯降低（P < 0.05）；首次排黑便時間較對照組明顯延長（P < 0.05）。見表1。

2.2 免疫熒光檢測兩組大鼠結(jié)腸中ICCs形態(tài)變化

ICCs胞質(zhì)和突起為棕黃色，且在黏膜下層、肌間層、內(nèi)環(huán)層及外縱層均有分布，其中肌間層區(qū)域最為顯著，鄰近的ICCs間突起可相互連接，圍繞肌間神經(jīng)節(jié)形成團狀結(jié)構(gòu)。其中對照組大鼠結(jié)腸組織中的ICCs細胞相互交織成密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)明顯的細胞多極性，細胞條形分支。造模成功后的STC大鼠腸道內(nèi)ICCs細胞數(shù)量明顯減少，雖形成網(wǎng)絡(luò)狀，但能明顯觀察到ICCs交互稀薄，細胞形狀窄細。見圖1（封四）。

2.3 TEM檢測ICCs自噬情況

與對照組比較，模型組中ICCs細胞自噬泡數(shù)量增大，提示模型組動物ICCs出現(xiàn)了明顯的細胞自噬現(xiàn)象，且細胞形態(tài)變化劇烈，基質(zhì)膜破解。對照組ICCs細胞胞體平滑且具有多個方向無規(guī)則狀的細胞分叉，細胞胞核突起細長且含有數(shù)個不同方向及類型的突觸小泡，細胞間交互相互連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)內(nèi)有相對較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及成熟的膨大高爾基體、線粒體等。見圖2。

2.4 免疫熒光法檢測STC大鼠ICCs中的鈣離子濃度

結(jié)果顯示，模型組大鼠ICCs中熒光斑點數(shù)量及熒光強度高于對照組。見圖3（封四）。

3 討論

STC的發(fā)病因素較多，機制較為復(fù)雜，其腸道功能紊亂涉及從食管到肛門的含黏膜的消化系統(tǒng)。該病是一種因結(jié)腸傳輸功能物滯留于結(jié)腸而引發(fā)的頑固性便秘。隨著便秘發(fā)生率的不斷攀升，越來越多的實驗開始對STC的發(fā)病機制進行研究，其中針對STC胃腸道動力障礙方面的機制研究較多，但對于自噬現(xiàn)象的發(fā)生影響尚無定論。

細胞自噬是在正常情況下細胞面對外界的不正常能量代謝，營養(yǎng)缺乏、代謝壓力等表現(xiàn)出的一種自我應(yīng)激反應(yīng)[7-8]。通常情況下，誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬是細胞內(nèi)外共同作用的結(jié)果[9-12]。Goodall等[13]發(fā)現(xiàn)細胞自噬可提高黑色素瘤腫瘤細胞的凋亡速率，加速促使了凋亡功能缺失的腫瘤細胞產(chǎn)生了自噬性的細胞“凋亡”。本研究為更好地闡明STC大鼠結(jié)腸ICC細胞的自噬現(xiàn)象發(fā)生的機制，采用復(fù)方苯乙哌啶制備模型，由于其為非特異性止瀉藥，能夠直接在腸平滑肌內(nèi)發(fā)揮功效，通過降低腸載膜感受器功能來阻止局部載膜的蠕動反射反應(yīng)，削弱腸蠕動活動，延遲腸內(nèi)容物排泄[14-15]，制備因腸蠕動抑制而致的STC。由于這種便秘模型與臨床上STC的病理生理過程較為相似，也為本研究奠定了一定的模型基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，通過免疫熒光法檢測腸道內(nèi)ICCs的表達變化情況以及TEM檢測慢性傳輸型大鼠腸道組織中ICCs細胞自噬泡，可見STC動物腸內(nèi)ICCs出現(xiàn)自噬性細胞死亡。文獻報道，人體腸腔的ICCs電子活動與ICCs中Ca2+濃度呈動態(tài)相關(guān)，Ca2+利用細胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（IP3-Kinase）的調(diào)控，在細胞質(zhì)內(nèi)形成內(nèi)流，部分Ca2+還能在線粒體內(nèi)產(chǎn)生電活動[16-21]。本研究觀察樣本組織中ICCs細胞自噬泡現(xiàn)象，表明STC大鼠ICCs的細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)了的大量的自噬泡以及自噬溶酶體降解后殘余的細胞器（如線粒體）等。為進一步檢測ICCs內(nèi)發(fā)生的細胞自噬是否與ICCs細胞內(nèi)Ca2+濃度超載存在一定的關(guān)系，本文又采用免疫熒光來檢測人體腸道肌群ICCs中游離的Ca2+水平變化，結(jié)果示STC大鼠腸道內(nèi)ICCs胞漿內(nèi)的游離Ca2+濃度增加?？梢姰斖饨绱碳せ蛘叻€(wěn)態(tài)不再平衡等情況發(fā)生時，會出現(xiàn)ICCs細胞內(nèi)Ca2+耗竭，進而激活鈣通道，大量細胞外鈣離子內(nèi)流，出現(xiàn)Ca2+超載，最終導(dǎo)致ICCs自噬性凋亡，引發(fā)STC。

綜上所述，本研究的實驗結(jié)果表明STC大鼠腸道內(nèi)ICC的數(shù)量減少是發(fā)生了細胞自噬現(xiàn)象。STC大鼠模型中ICC細胞內(nèi)游離Ca2+升高，Ca2+升高可能是導(dǎo)致ICC自噬性死亡的原因。本研究對于下一步研發(fā)針對ICCs的新型藥物或者診療手段具有較強的臨床指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。

[參考文獻]

[1] 高紡，盛紅梅，張?zhí)飳?，?針刺不同穴方對便秘小鼠腸運動的影響[J].針刺研究，2017，42（1）：62-66，75.

[2] 陳健海，仲婕，王凡，等.胃腸道Cajal間質(zhì)細胞起搏功能的研究進展[J].中國病理生理雜志，2017，33（1）：184-188.

[3] Tian H，Ge X，Nie Y，et al. Fecal microbiota transplantation in patients with slow-transit constipation：arandomized，clinical trial [J]. PLoS One，2017，12（2）：e0 171 308.

[4] 程闊菊，羅云，彭雷，等.Cajal間質(zhì)細胞在胃腸功能紊亂中的研究進展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2015，24（6）：749-750.

[5] Wang F，Tang J，Li P，et al. Chloroquine enhances the rad？鄄iosensitivity of bladder cancer cells by inhibiting aut？鄄ophagy and activating apoptosis [J]. Cell Physiol Biochem，2017，45（1）：54-66.

[6] 韋勇，楊四軍.細胞自噬的調(diào)控與自噬程序性死亡的研究進展[J].國際免疫學(xué)雜志，2016，39（5）：493-497.

[7] Cheng Z，Zhao K，Bi D. Simultaneous degeneration of mye？鄄nteric plexuses andpelvic parasympathetic colonic nerve in slow transit constipation：a case report [J]. Medicine （Bal？鄄timore），2017，96（11）：e6390.

[8] Raut PK，Choi DY，Kim SH，et al. Estrogen receptor sig？鄄naling mediates leptin-induced growth of breast cancer cells via autophagy induction [J]. Oncotarget，2017，8（65）：109 417-109 435.

[9] Zhu F，Xu S，Zhang Y，et al. Total glucosides of paeony promote intestinal motility in slow transit constipation rats through amelioration of interstitial cells of Cajal [J]. PLoS One，2016，11（8）：e0 160 398.

[10] Liu K，Huang J，Xie M，et al. MIR34A regulates autop？鄄hagy and apoptosis by targeting HMGB1 in the retinob？鄄lastoma cell [J]. Autophagy，2014，10（3）：442-452.

[11] Booth LA，Tavallai S，Hamed HA，et al. The role of cell signalling in the crosstalk between autophagy and apo？鄄ptosis [J]. Cell Signal，2014，26（3）：549-555.

[12] Xie JM，Li B，Yu HP，et al. TIGAR has a dual role in cancer cell survival through regulating apoptosis and autophagy [J]. Cancer Res，2014，74（18）：5127-5138.

[13] Goodall ML，Wang T，Martin KR，et al. Development of potent autophagy inhibitors that sensitize oncogenic BRAF V600E mutant melanoma tumor cells to vemura？鄄fenib [J]. Autophagy，2014，10（6）：1120-1136.

[14] Meyers MJ，Anderson EJ，McNitt SA，et al. Evaluation of spiropiperidinehydantoins as a novel class of antimalarial agents [J]. Bioorg Med Chem，2015，23（16）：5144-5150.

[15] Egbertson M，McGaughey GB，Pitzenberger SM，et al. Methyl-substitution of an iminohydantoinspiropiperidine β-secretase（BACE-1）inhibitor has a profound effect on its potency [J]. Bioorg Med Chem Lett，2015，25（21）：4812-4819.

[16] Shin DH，Kim MW，Choi S，et al. Regulation of the pacemaker activity of colonic interstitial cells of Cajal by protease-activated receptors：involvement of hyperpola？鄄rization-activated cyclic nucleotide channels [J]. Pharm？鄄acology，2016，98（3-4）：171-182.

[17] Kim HJ，Wie J，So I，et al. Menthol modulates pacemaker potentials through TRPA1 channels in cultured inter？鄄stitial cells of Cajal from murine small intestine [J]. Cell Physiol Biochem，2016，38（5）：1869-1882.

[18] Koleda P，Pilecki W. Nature of interstitial cells of Cajal of the upperurinary tract [J]. Adv Clin Exp Med，2014， 23（4）：627-632.

[19] Kim HJ，Han T，Kim YT，et al. Magnolia officinalis bark extract induces depolarization of pacemaker potentials through M2 and M3 muscarinic receptors in cultured murine small intestine interstitial cells of Cajal [J]. Cell Physiol Biochem，2017，43（5）：1790-1802.

[20] Kim HJ，Kim BJ. Naringenin inhibits pacemaking activity in interstitial cells of Cajal from murine small intestine [J]. Integr Med Res，2017，6（2）：149-155.

[21] Radu BM，Banciu A，Banciu DD，et al. Calcium sign？鄄alingin interstitial cells：focus on telocytes [J]. Int J Mol？鄄Sci，2017，18（2）：113-115.

（收稿日期：2017-12-06 本文編輯：李岳澤）