焦嬋，師彥潔

(河南開封大學(xué)，河南 開封 475000)

茉莉酸(JA)及茉莉酸甲酯(MeJA)是亞麻酸衍生的具有環(huán)戊酮基團的化合物。茉莉酸廣泛分布于植物果實、花、種子、苗、胚芽、葉、莖、根尖等部位。大量的研究表明，茉莉酸類物質(zhì)對植物生長有廣泛的生理作用，歸納起來包括促進，抑制和誘導(dǎo)三個方面，促進呼吸作用、乙烯生物合成、氣孔關(guān)閉、葉片脫落、過氧化氫酶活性等，抑制根的生長、幼苗生長、光合作用、種子花粉萌發(fā)等，誘導(dǎo)逆境蛋白、蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等。并且發(fā)現(xiàn)茉莉酸類物質(zhì)有類似脫落酸的效用，即在生理功能和代謝過程中起到激素的作用。研究表明，茉莉酸(酯)類物質(zhì)可以作為內(nèi)源信號分子與植物抗性密切相關(guān)，當(dāng)植物受到機械傷害、干旱、低溫、病蟲害、低溫等逆境時，植物體內(nèi)的茉莉酸類化合物含量會迅速增加，進而誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達，如苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、蛋白酶的抑制劑等，使未受到傷害的部位及時抵抗不良的環(huán)境。

Gorbineau等(1988)在研究JAMe對向日葵種子萌發(fā)和幼苗生長的影響時發(fā)現(xiàn)10-5-10-3mol/L的JAMe可以顯著的抑制初生根根長，而且濃度越高，抑制作用越大。Ravnikar等(1992)的實驗結(jié)果也表明，外用不同濃度的JA可對馬鈴薯根系產(chǎn)生不同的影響，濃度高于10 μmol/L會對根系生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。劉或等試驗發(fā)現(xiàn),高濃度的M J處理，能使小麥根中過氧化物酶的活性提高，防止細胞壁的延伸,從而達到阻礙小麥生長的作用。

在光合生物產(chǎn)生氧氣的同時，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)即作為副產(chǎn)物隨之出現(xiàn)。生物體內(nèi)的ROS包括超氧物陰離子(O2-)、H2O2、單線態(tài)氧(O21)及羥自由基(·OH)等,它們均具有較高的活性和毒性。正常情況下植物光合作用和呼吸作用產(chǎn)生的ROS水平較低，但很多脅迫包括干旱、鹽害、冷害、重金屬、紫外輻射、臭氧、機械傷害、營養(yǎng)缺乏、病原體入侵、高光強等均導(dǎo)致光合電子傳遞鏈及呼吸鏈產(chǎn)生過量ROS，還誘導(dǎo)NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS，對細胞造成氧化毒害。H2O2是活性氧的一種，是細胞有氧代謝的產(chǎn)物。越來越多的實驗證據(jù)表明，H2O2不僅具有損傷生物大分子產(chǎn)生細胞毒害性作用的能力，而且具有多種多樣的生理功能。光、環(huán)境脅迫和植物激素ABA可以引起植物體內(nèi)H2O2升高，而H2O2作為一個較早進化出來的信號分子，不僅在誘導(dǎo)氧化性光合作用中起了關(guān)鍵的作用，并且可以調(diào)節(jié)諸如氣孔運動、超敏反應(yīng)、細胞凋亡和基因表達等許多過程。細胞內(nèi)H2O2濃度必須維持在一種精細平衡狀態(tài),它一方面可以通過質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)和光呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生，另一方面也存在完善的清除機制?？傊?H2O2作為信號分子調(diào)控基因的表達,是一個十分有趣而值得探討的問題。綜上,H2O2作為植物的第二信使,已成為逆境生物學(xué)研究的重要課題,并且它作為信號分子的研究工作已取得了很大的進展。

植物擬南芥基因組存在10個NADPH氧化酶的同源基因,但是直到最近才證明這些基因在產(chǎn)生H2O2中的作用和功能，但其中只有C、D、F這3個基因在擬南芥根中表達，所以本實驗借助于擬南芥這3個基因的突變體，研究MeJA在抑制根生長中的生物學(xué)機制。

1 實驗材料與方法

1.1 材料。野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子經(jīng)0.1 %升汞表面消毒5-6 min,用無菌水沖洗3-5次,將其點種于MS固體培養(yǎng)基上,用封口膜封好,在4 ℃下春化2-3天后,置于光照充足的培養(yǎng)室中.生長條件為:光/暗周期16/8 h，溫度18-23 ℃,相對濕度80 %左右,光照強度90 μmol·m-2·s-1,晝夜溫度分別為23±2 ℃，生長期間無任何脅迫。

1.2 MS培養(yǎng)基。(1)按比例從母液中吸取大量元素(50×)，微量元素(1000×)，鐵鹽(200×)，鈣鹽(50×)，有機物(100×)。(2)加入蔗糖(3%)。(3)調(diào)PH至6.0。(4)加入瓊脂粉(0.6%)或(1.2%)。(5)高溫高壓滅菌(121 ℃，15 min)。(6)在超凈工作臺上將適量的MS培養(yǎng)基倒入已滅菌的潔凈培養(yǎng)皿中。

1.3 不同濃度的JAMe處理。先配置MS固體培養(yǎng)基,在倒平板時分別向各個培養(yǎng)皿中加入不同濃度(0、0.5、5、50 μmol/L)的JAMe和無菌水(對照)，每個濃度各兩個平皿，然后將野生型擬南芥(wt)和3種擬南芥過氧化氫酶突變體(C、D、F)的種子分別整齊得點于各個不同濃度的培養(yǎng)皿中,然后用封口膜封好，在4 ℃下春化2-3天后，置于光照充足的培養(yǎng)室培養(yǎng)3天。

1.4 測量根長。對各個JAMe不同濃度的培養(yǎng)皿中擬南芥的根長進行測量，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，連續(xù)測量7天，然后對每個培養(yǎng)皿的相關(guān)數(shù)據(jù)求其平均值及平行實驗中的方差，并做出圖表，比較不同濃度下根長的大小，進一步得出實驗結(jié)論。

1.5 DAB染色

DAB：二胺基聯(lián)苯胺

DAB溶液的配制：稱取100 mgDAB于避光的有色瓶中，利用已經(jīng)稀釋的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至3.8或其以下，用玻璃棒不斷攪拌，在溶解過程中溶液的PH值不斷升高，所以需要不時地調(diào)節(jié)pH值，使其充分溶解。

染色過程：取適量DAB染液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8，然后分裝于被錫箔紙包裹的EP管中，將擬南芥的幼苗放入其中，用錫箔紙包好后放置于28 ℃恒溫箱中，避光染色8 h。

脫色過程：吸去DAB染液，加入80 %的乙醇1 ml，放置于沸水中10 min

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于沸水中至葉片綠色完全脫去

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于4 ℃冰箱中保存

1.6 NBT染色

NBT：itroblue tetrazolium 氮藍四唑

NBT染液的配制：稱取1.1915 g Hepes，將其溶解于ddH2O中，定容至100 ml，然后調(diào)節(jié)pH值到7.6，用25 ml Hepes緩沖液(pH7.6)，并加入0.1 %TritonX-100配制成終濃度為0.1 mg/ml的溶液。

染色過程：取適量NBT染液，然后分裝于被錫箔紙包裹的EP管中，將擬南芥的幼苗放入其中，用錫箔紙包好后放置于28 ℃恒溫箱中，避光染色2 h。

脫色過程：吸去NBT染液，加入80 %的乙醇1 ml，放置于沸水中10 min

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于沸水中至葉片綠色完全脫去

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于4 ℃冰箱中保存

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度的茉莉酸甲酯對野生型擬南芥(wt)根生長的影響

由圖1可明顯看出，與對照相比，外施不同濃度的茉莉酸甲酯(0.5、5、50 μmol/L)均可以抑制野生型擬南芥根的生長,且隨著茉莉酸甲酯濃度的增加,根生長受抑制的程度也逐漸增大。

圖1在茉莉酸甲酯的不同濃度下(0、0.5、5、50 μmol/L)野生型擬南芥(wt)的根6天的生長情況

2.2 茉莉酸甲酯對野生型擬南芥(wt)和突變體(C、D、F)根生長的影響

由圖2數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可以看出茉莉酸甲酯不同濃度對野生型擬南芥(wt)和突變體(C、D、F)根生長的影響差異并不大。

圖2擬南芥(C、wt、D、F)在不同濃度的茉莉酸甲酯(0、5、50 μmol/L)的作用下第七天的生長情況

2.3 DAB染色結(jié)果

未經(jīng)茉莉酸甲酯處理和經(jīng)過茉莉酸甲酯處理過的擬南芥在DAB染色后,根的染色結(jié)果差異并不大，所以可以認為H2O2在茉莉酸甲酯抑制擬南芥根生長的過程中在根部不發(fā)揮作用。

圖3 DAB染色結(jié)果

2.4 NBT染色結(jié)果

未經(jīng)茉莉酸甲酯處理和經(jīng)過茉莉酸甲酯處理過的擬南芥在經(jīng)過NBT染色后,根的染色結(jié)果差異并不大，所以可以認為H2O2在茉莉酸甲酯抑制擬南芥根生長的過程中不發(fā)揮作用。

圖4 NBT染色結(jié)果

3 討論

鑒于ABA與茉莉酸甲酯的功能相似性，已有的研究表明它們在執(zhí)行功能時信號途徑類似，如在誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉時都可以產(chǎn)生活性氧，所以我們關(guān)注在抑制根生長時它們的機制是否一致，由于有研究表明活性氧在ABA抑制根生長的過程中是發(fā)揮作用的，所以我們可以認為JAs和ABA抑制擬南芥根的生長機制是不同的。

參考文獻：

[1] 吳文華,潘瑞熾.茉莉酸類物質(zhì)的生物合成及其作用特點.植物學(xué)通報,1996,13(增刊):39-45

[2] 谷麗萍,周阮寶.茉莉酸在值物體內(nèi)作用的研究進展[J].植物學(xué)通報,1997,14:31-35.

[3] 薛仁鎬,金圣愛.茉莉酸甲酯：一種重要的植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子.生物技術(shù)通報,2006,17:985-989.

[4] Corbineau F,Rudnicki RM,Come D.The Effects of methyl jasmonate on sunflower(Helianthus annuus L.)seed germination and seedling development.Plant Growth Regul,1988,7:157-169.

[5] Ravnikar M,Zel J,Plaper I,Spacapan A.Jasmonic acid.stimulates shoot and bulb formation of glarlic in vitro.Plant.Growth Regul,1994,12:73-77.

[6] Torres M A,Dangl J L,Jones J D G.Arabidopsis gp91phox homologues AtrbohD and AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:517-522.

[7] Gapper C,Dolan L.Control of plant development by reactive oxygen species.Plant Physiol,2006,141:341-345.

[8] Torres M.A,Onouchi H,Hamada S,Machida,Hammond-Kossack K.E.,Jones J.D.Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase(gp91phox).Plant J,1998,14:365-370.