（天津天獅學院生物與食品工程學院，天津 301700）

蜜環(huán)菌（Amillariella mellea）是一種藥食兩用真菌，多作為藥材天麻的伴生菌。工業(yè)化生產(chǎn)多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)[1]，發(fā)酵液中富含多種活性成分，以蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)出的眾多商品[2]。漆酶（EC 1.10.3.2）是蜜環(huán)菌發(fā)酵液中積累的一種綠色環(huán)保型多酚氧化酶，其活性中心含有金屬離銅，可以催化酚類及芳胺類物質(zhì)的聚合、降解及轉(zhuǎn)化，近年來在在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品[3]、廢水處理[4-5]和醫(yī)藥[6]等領(lǐng)域市場前景廣闊[7]。

以深層液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)可以提高漆酶的產(chǎn)率，許多學者致力于研究漆酶生產(chǎn)的發(fā)酵條件。司靜等[8]分別以麥芽糖和蛋白胨作為碳源和氮源，篩選出漆酶高產(chǎn)菌株為東方栓孔菌Trametes orientalis Cui. 6300，一定程度上縮短漆酶生產(chǎn)周期。徐雪霏等[9]對黃多孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的條件進行優(yōu)化，提高酶活2.5倍，發(fā)現(xiàn)影響該菌產(chǎn)生漆酶的主要營養(yǎng)因素為碳氮比。實驗證明漆酶發(fā)酵較適pH多集中在4.0～6.0，不同的真菌有它們各自的最佳pH，且底物不同，最適發(fā)酵pH也差異明顯[10-12]。目前，漆酶的研究還在探索，很多方面需要完善，對漆酶發(fā)酵的研究暫時還主要在實驗室中進行，產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的優(yōu)化和大規(guī)模生產(chǎn)是將來發(fā)展的趨勢，漆酶的價值會緊跟著科技時代的步伐，慢慢地被世人所熟知。

本研究利用實驗室培養(yǎng)保存的蜜環(huán)菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，改變培養(yǎng)條件，測定發(fā)酵液中漆酶的活性，對蜜環(huán)菌產(chǎn)漆酶的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，旨在找出適宜大批生產(chǎn)的操作方案，為企業(yè)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

蜜環(huán)菌A9，購于華中農(nóng)業(yè)大學菌種實驗中心，經(jīng)天津天獅學院生物工程實驗中心擴大培養(yǎng)用于試驗。

1.1.2 試驗試劑

葡萄糖、可溶性淀粉、2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（簡稱ABTS，Sigma-Alorich生產(chǎn)）等，購于上海藍季科技發(fā)展有限公司；七水硫酸鎂、氯化鈣、氯化銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白胨等，購于天津市風船化學試劑科技有限公司；玉米粉、麥麩，購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.3 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)搖床HNY-200B，天津歐諾產(chǎn)；臺式高速離心機TG16K-II，長沙東旺產(chǎn)；賽多利斯天平BSA124S，德國產(chǎn)；高壓蒸汽滅菌鍋MJ-78A，上海施都凱產(chǎn)；紫外可見分光光度計UV1000，上海天美產(chǎn)；超凈工作臺SW-CJ-2G，蘇州凈化產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗培養(yǎng)基的制備

將1 L去離子水倒入電磁爐中，分別加入80 g麥麩，200 g馬鈴薯小塊，大火煮沸后溫火煮20 min，8層紗布過濾，用去離子水補足溶液至1 L。分別添加1.5 g MgSO4·7H2O、2 g KH2PO4、0.1 g CaCl2，0.01 g 維生素B1，用氫氧化鈉和檸檬酸調(diào)整培養(yǎng)液的pH至6.0作為基本培養(yǎng)基。

公式中Kjaccard和Ksorensen為科、屬、種相似性系數(shù)，A、B分別為兩地區(qū)植物科、屬、種數(shù)，C為兩地區(qū)共有植物科、屬、種數(shù)。

根據(jù)研究目的不同，在基本培養(yǎng)基中添加不同葡萄糖和蛋白胨分別作為碳源和氮源，添加一定量的微量元素，微量元素溶液見表1。

表1 微量元素溶液成分表

1.2.2 液體菌種制備及接種培養(yǎng)

將蜜環(huán)菌斜面菌種接種到綜合PDA平板上25 ℃黑暗培養(yǎng)活化14 d。在超凈臺下，用打孔器取長勢一致的菌絲，接種于液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，收集菌絲體懸液作為液體菌種。接種時，在超凈臺下用取液器精確吸取2 mL加入到不同試驗組，在25 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)。

1.2.3 酶活力測定

搖床培養(yǎng)15 d后，取出一定量的發(fā)酵液，經(jīng)5 000 r/min離心20 min后，取上清液測試酶活力[13-14]，酶活力單位定義為1 min轉(zhuǎn)化1 μmol ABTS，使ABTS自由基濃度增加量。每個處理做3次重復取平均值作為酶活力。

1.2.4 單因素試驗研究

（1）葡萄糖添加量對漆酶酶活的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖15、20、25、30 g和35 g，蛋白胨4 g，加入10 mL微量元素溶液，每個水平分別做3次重復，接種培養(yǎng)15 d后，測定酶活力，記錄結(jié)果（下同）。

（3）初始pH對漆酶酶活的影響。在基本培養(yǎng)基中添加20 g葡萄糖，C/N為5，添加10 mL微量元素溶液pH為分別調(diào)節(jié)到5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，培養(yǎng)后測定并記錄結(jié)果。

（4）微量元素添加量對漆酶酶活的影響 在基本培養(yǎng)基中添加20 g葡萄糖，C/N為5，溶液pH調(diào)節(jié)6.0，添加微量元素溶液量分別為5、10、15、20 mL和25 mL，培養(yǎng)后測定并記錄結(jié)果。

1.2.5 正交試驗研究

通過單因素優(yōu)選的四個不同因素的三個水平，采用L9（34）正交實驗設(shè)計，進一步確定因素的主次及發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖添加量對漆酶酶活的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別按1.5%～3.5%的量添加葡萄糖，其他培養(yǎng)條件不變，研究葡萄糖的添加量對產(chǎn)漆酶的酶活的影響，發(fā)酵至15 d后取上清液進行測定酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同葡萄糖添加量對蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖1可見，葡萄糖添加量對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的酶活力隨著葡萄糖的增加，漆酶的酶活先升高后緩慢下降的趨勢。當1 L培養(yǎng)基中添加2.5%葡萄糖時產(chǎn)漆酶量最多。繼續(xù)增加含糖量可能對蜜環(huán)菌的生長產(chǎn)生部分抑制作用，分泌的胞外漆酶量略微下降。可見，在培養(yǎng)時過高的葡萄糖濃度既不經(jīng)濟，又不利于蜜環(huán)菌的生長。

2.2 不同碳氮比對漆酶酶活的影響

保持碳源氮源總量不變的前提下，以葡萄糖作為碳源，蛋白胨做氮源，設(shè)置5個不同水平的C/N，研究其對蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶酶活的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同碳氮比對蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖2可見，在碳氮源總量不變的前提下，隨碳源增加，蜜環(huán)菌分泌的胞外漆酶酶活力呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，反映出同葡萄糖效應(yīng)同樣的影響效果。當1 L培養(yǎng)基中添加22.5 g葡萄糖和7.5 g蛋白胨（即C/N=3）時產(chǎn)漆酶量最多。

2.3 不同初始pH對漆酶酶活的影響

調(diào)整配制完畢的培養(yǎng)基的pH在5～7共5個水平，分別測定發(fā)酵后的漆酶產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同初始pH對蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖3可見，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH維持在5～6時，蜜環(huán)菌生產(chǎn)的胞外漆酶活性較高。此范圍的pH跟基本培養(yǎng)基配制完后的pH接近，在生產(chǎn)漆酶時，可以考慮不用調(diào)整pH，保持自然的pH即可。pH繼續(xù)升高，漆酶產(chǎn)量明顯降低，主要是由于較高pH對蜜環(huán)菌的生長有一定地抑制作用。

2.4 不同微量元素添加量對漆酶活力的影響

通過只改變微量元素的添加量，分別加入5～25 mL微量元素溶液，其他培養(yǎng)條件一致的情況下，培養(yǎng)完成后測定酶活力如圖4所示。

圖4 不同微量元素溶液添加量對蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖4可見，添加適量微量元素對蜜環(huán)菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶有益，可以促進菌體的生長，進而增加發(fā)酵液中漆酶的酶活。當1 L培養(yǎng)基中添加10 mL微量元素溶液時，發(fā)酵完成后漆酶活力達到峰值。加入過多的微量元素，漆酶的產(chǎn)量明顯下降，可推斷其對蜜環(huán)菌的生長存在抑制作用。

2.5 正交實驗結(jié)果及分析

根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，從4個因素中各自選取3個水平進行L9（34）正交實驗設(shè)計。因素水平表設(shè)計見表2，正交實驗的結(jié)果見表3。

表2 因素水平表

由表3可知，影響蜜環(huán)菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的因素主次順序依次為葡萄糖添加量、C/N、微量元素添加量和初始pH?？梢娫谂囵B(yǎng)基中的碳源對蜜環(huán)菌產(chǎn)漆酶影響較大，需要對添加碳源的種類進一步研究，確定最佳碳氮比以提高漆酶的生產(chǎn)效率。pH對產(chǎn)漆酶的影響相對較小，因而可以考慮配制基本培養(yǎng)基后，按照自然的pH進行發(fā)酵。

表3 正交實驗的結(jié)果表

2.6 驗證結(jié)果及分析

按照以上結(jié)果中最優(yōu)方案，進行3次重復實驗，測得1 L發(fā)酵液中漆酶活力為51202.0U，相對標準偏差小于5%。高于正交表格中實驗數(shù)值，說明此工藝的優(yōu)越性。

3 結(jié)論與討論

確定蜜環(huán)菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)漆酶的最佳方案為添加葡萄糖2.5%，碳源氮源比為3，基本培養(yǎng)基中附加15 mL/L微量元素，pH5.0為最有利于漆酶的積累?？勺鳛楣I(yè)生產(chǎn)漆酶的參考方案。在實際生產(chǎn)過程中，由于pH的影響較小，可以直接利用配制完成的培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)，無需調(diào)整pH。

發(fā)酵生產(chǎn)胞外漆酶的最適培養(yǎng)時間出現(xiàn)在14 d左右，此時酶活力最高，本次研究統(tǒng)一在15 d采集樣品測定活力。比蜜環(huán)菌達到最大生長量的時間（10 d左右）有所滯后，說明當蜜環(huán)菌達到最大生長量后，胞外積累的漆酶數(shù)量才可達到峰值，從動力學角度分析，這種胞外漆酶的合成模型可能屬于滯后合成型，需要進一步的研究確定，此時是分離純化漆酶的最佳時間段。培養(yǎng)時間再長漆酶可能發(fā)生部分降解，影響產(chǎn)量。

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