◎ 烏吉木

（巴彥淖爾市食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

1 概述

1.1 測量依據(jù)

GB 5009.22-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》。

1.2 測量環(huán)境

溫度：20 ℃；相對濕度：37%RH。

1.3 測量設(shè)備及試劑

安捷倫1260附熒光檢測器，C18，填料直徑5μm，內(nèi)徑4.6 mm，柱長250 mm，柱后衍生：用AURAINDUSTRIES instrumentation for science碘衍生柱；電子分析天平0～200 g 0.01 g Ⅲ級；黃曲霉毒素免疫親和層析柱：VICAM Made in the U.S.A； 甲 醇（CH3OH）： 色 譜 純Honeywell；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：國家糧食局科學(xué)研究院（質(zhì)量濃度1.96 μg/mL，不確定度0.09 μg/mL）。

1.4 測量對象

植物油。

1.5 測量方法

準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g于50 mL離心管中，加入1.0 g氯化鈉及加入甲醇-水（7+3）至25 mL（V1）搖勻提取2 min，定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0 mL（V2）濾液并加入10.0 mL（V3）水稀釋，用定量濾紙過濾一次，備用。臨用時搖勻。

凈化：將免疫親和柱連接于20.0 mL一次性注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL（V4）樣品提取液注入一次性注射器內(nèi)，接注射器上方手推注射器讓液體以約6 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3 mL空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使2～3 mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0 mL（V）色譜級進(jìn)口甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min，收齊全部洗脫液于玻璃試管中，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑昧鲃酉喽ㄈ葜?.0 mL，旋渦30 s溶解殘留物，經(jīng)濾膜（0.22 μm）過濾后進(jìn)高效液相色譜儀，具體見表2，然后由公式計算出黃曲霉毒素B1的含量。

2 數(shù)學(xué)模型

式中，C為樣液中黃曲霉毒素B1的濃度（μg/L）；m為樣品質(zhì)量（g）；V為最終甲醇洗脫液體積（mL）；w為最終凈化洗脫液所含試樣質(zhì)量（g）；V1為樣品和提取液總體積（mL）；V2為稀釋用樣品濾液體積（mL）；V3為稀釋液體積（mL）；V4為通過親和柱的樣品提取液體積（mL）；X為樣品中黃曲霉毒素B1的含量（μg/kg）。

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

3.1 A類不確定度的計算

實驗操作人員技術(shù)水平，儀器設(shè)備的性能均會影響結(jié)果的重復(fù)性，以重復(fù)條件下標(biāo)準(zhǔn)偏差量化。該不確定度屬A類評定，對同一樣品進(jìn)行10次重復(fù)測定，實驗結(jié)果見表1。

表1 黃曲霉毒素B1的測定重復(fù)性表

3.2 B類不確定度的計算

3.2.1 樣品稱量引起的不確定度

TD2002A型電子天平準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g（精確到0.01 g），檢定證書給出最大允許誤差0.05 g（0≤m≤500 g）。由天平引入的不確定度可按B類評定，屬均勻分布，樣品稱量引入的相對不確定度：

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引起的不確定度

（1）本方法采用的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.96 μg/mL，不確定度0.09 μg/mL，k=2為B類評定u標(biāo)1=0.09/2=0.045。

（2）該標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)2次稀釋配成標(biāo)準(zhǔn)工作液，即準(zhǔn)確移取1.3 mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇水定容至刻度并充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液，準(zhǔn)確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中用甲醇水定容至刻度并充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)使用液。

第1次稀釋，定容引起的不確定度：依據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》2.0 mL移液管A級允許誤差±0.012 mL，按B類評定，正態(tài)分布，99%概率計相對不確定度：

25 mL容量瓶的體積容量允許誤差±0.03 mL，相對不確定度：

3.2.3 曲線擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本實驗共選取5個標(biāo)準(zhǔn)濃度，每個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重復(fù)測定3次，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積測定結(jié)果見表1。

由表2的數(shù)據(jù)擬合得到線性方程：A=1.764 01C，斜率k=1.764 01，相關(guān)系數(shù)r=0.999 656，標(biāo)準(zhǔn)曲線偏差數(shù)據(jù)計算結(jié)果見表3。

表2 不同濃度黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定結(jié)果表

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線偏差數(shù)據(jù)計算結(jié)果表

3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制工程中使用了表4中一系列的玻璃量具，均有相應(yīng)的最大允差按矩形分布考慮由此計算出相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中量具校準(zhǔn)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

由表4合成：

最后配制標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對不確定度如下：

3.2.5 檢測方法引起的不確定度

該方法依據(jù)GB5009.22-2016測定過程包括樣品的提取、凈化、淋洗、濃縮、定容等過程中都會引入誤差，但在實際使實驗過程中樣品的提取、過濾、免疫親和柱凈化等操作引入的不確定度是難以量化的，結(jié)合實際工作可以引入回收率。

本方法中加標(biāo)回收率分別為89.52%，90.08%，83.60%，83.44%，87.44%，85.08%，83.08%，85.48%，平均值為85.965%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

樣品回收率的不確定度u回=S回

3.3 不確定度的合成

依據(jù)不確定度合成公式，該植物油樣品中黃曲霉毒素B1的不確定度分量值見表5。

表5 植物油樣品中黃曲霉毒素B1含量的測量不確定度分量值表

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成：

取置信概率P=95%，k=2，則擴(kuò)展確定度為：

植物油中黃曲霉毒素B1測量結(jié)果為：

3.4 環(huán)境溫度引起的不確定度

實驗室環(huán)境溫度的變化會引起試劑體積的變化，導(dǎo)致實驗誤差增大。本實驗室內(nèi)環(huán)境溫度用空調(diào)控制室溫在20 ℃，變化較小，由溫度變化引起的不確定度本文沒有參與評定。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定植物油樣品中黃曲霉毒素B1含量時，影響測量不確定度的主要因素為電子天平示值誤差、移液管和容量瓶等使用引起的容量允差、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、方法的回收率、溫度變化、儀器設(shè)備引入的測量重復(fù)性誤差，通過分析表5中不確定度分量得到，影響黃曲霉毒素B1含量的最主要因素是測量重復(fù)性、方法的提取回收率、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。