吳軍，文亞紅，唐永江

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CAD）是由于冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生粥狀硬化引起心肌缺血或壞死的一類心臟疾病，其中先天性炎癥反應(yīng)在冠心病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）是目前臨床治療冠心病主要策略之一[2]。臨床發(fā)現(xiàn)糖尿病能增加PCI術(shù)不良并發(fā)癥的發(fā)生率，誘發(fā)心肌梗死[3]，其機(jī)制尚不清楚。Toll樣受體（TLRs）是最常見的先天性免疫受體，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化，產(chǎn)生分泌多種炎癥相關(guān)因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，參與冠心病、糖尿病等多種疾病發(fā)生發(fā)展過程[4]。本研究通過檢測TLR3、TLR4、IL-10、TNF-α在糖尿病、非糖尿病冠心病患者PCI后表達(dá)水平，探討它們與冠心病合并糖尿病患者術(shù)后不良事件發(fā)生率的相關(guān)性，試圖揭示冠心病合并糖尿病患者發(fā)生不良心臟事件的原因。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年3月～2017年1月于攀枝花市中心醫(yī)院心內(nèi)科收治的穩(wěn)定型冠心病患者90例根據(jù)是否合并2型糖尿?。═2DM）分為糖尿病組（T2DM組）39例、非糖尿病組（非T2DM組）51例。所有患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確定冠狀動(dòng)脈狹窄并成功行PCI術(shù)。T2DM組男性22例，女性17例；平均年齡（60.5±3.1）歲；平均病程（1.6±1.1）年。非T2DM組男性29例，女性22例，平均年齡（61.9±2.7）歲；平均病程（1.8±0.9）年。兩組患者的性別、年齡及病程等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①穩(wěn)定型心絞痛：以發(fā)作性胸骨后疼痛為特點(diǎn)，發(fā)作特征1～3月內(nèi)無改變，每日及每周發(fā)作次數(shù)大致相同，誘導(dǎo)發(fā)作的情緒和勞累程度無差別，每次發(fā)作時(shí)疼痛性質(zhì)及發(fā)作部位無改變。②T2DM：參照2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)修訂的中國2型糖尿病防治指南[5]，空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L及（或）75 g 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）后2 h血糖值≥11.1 mmol/L并排除1型糖尿病，即診斷為T2DM。③支架植入術(shù)指征：參照2014年SCAI/ACC/AHA修訂[6]的PCI治療標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈直徑狹窄≥90%；狹窄＜90%，有相應(yīng)缺血證據(jù)，或血流儲(chǔ)備分?jǐn)?shù)（FFR）≤0.8，排除支架植入禁忌癥者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他心臟??；不穩(wěn)定型心絞痛；既往有PCI術(shù)史；腎、肝功能異常；合并出血性疾病，不耐受長期抗血小板治療；合并免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腫瘤、感染等疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，且臨床標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 標(biāo)本采集及保存 分別在PCI術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后7 d、術(shù)后30 d采集各組患者肘靜脈血（5 ml/人），置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血，收集單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和血清，于-70℃保存，冷藏保存。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測TLR3、TLR4 mRNA表達(dá)情況 Trizol法提取PBMC總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板在Bio-Rad定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)總體系10 μl，具體如下：正反向引物（10 μmol/L）各0.3 μl，SYBR? Green Master Mix 5 μl，cDNA（100 ng/μl）0.5 μl，RNase-free H2O 3.9 μl。反應(yīng)條件：95℃，60s；95℃，15s；60℃，30s；72℃，15s；40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。每個(gè)樣品進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 Western blot檢測TLR3、TLR4蛋白表達(dá) 采用BCA試劑盒測定血清中蛋白總量。以β-actin作為內(nèi)參，嚴(yán)格按照Western blot操作說明，檢測患者血清中TLR3、TLR4蛋白表達(dá)水平。采用Tanon軟件采集圖像并對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.3.3 ELISA檢測血清中IL-10、TNF-α含量 采用ELISA試劑盒嚴(yán)格按照操作說明檢測患者血清中IL-10、TNF-α含量。

1.3.4 臨床隨訪 所有患者均成功行PCI，術(shù)后依據(jù)病情給予他汀類等藥物治療。術(shù)后1年內(nèi)接受復(fù)檢隨訪，記錄主要心臟不良事件，包括死亡、心絞痛、心肌梗死。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。影響PCI后心臟不良事件的因素采用多因素logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者PCI前、后一般情況 T2DM組術(shù)前吸煙率、高血脂率、高血壓率、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及冠心病預(yù)防藥物使用率與非T2DM組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后30 d，兩組患者低密度脂蛋白[（3.55±0.73）mmol/Lvs.（3.07±0.96）mmol/L]及血糖值[（9.16±2.65）mmol/Lvs.（7.23±2.25）mmol/L）]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011、0.000），見表2。

表2 兩組患者PCI術(shù)前一般情況比較

2.2 兩組患者冠狀動(dòng)脈病變情況比較 與非T2DM組相比，T2DM組患者3支病變率較高（25.6%vs.9.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046）。兩組患者1支、2支病變率及病變發(fā)生部位方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.3 兩組患者外周血中TLR3、TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)比較 PCI前、后24 h、7 d、30 d比較，T2DM組患者TLR3mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于非T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.13±0.64vs. 1.37±0.29）、（1.69±0.67vs. 1.89±0.21）、（1.96±0.16vs. 2.07±0.13）、（2.39±0.53vs. 3.15±0.76），P＜0.05]，TLR4mRNA水平明顯高于非T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.41±0.56vs. 1.17±0.72）、（1.21±0.27vs. 0.89±0.25）、（0.87±0.75vs. 0.61±0.39）、（0.61±0.15vs. 0.47±0.26），P＜0.05）；行PCI術(shù)后，兩組患者TLR3mRNA相對(duì)表達(dá)水平均隨著術(shù)后時(shí)間的延長呈增高趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）、TLR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平均呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 兩組患者冠狀動(dòng)脈病變情況比較

2.4 兩組患者外周血中TLR3、TLR4蛋白表達(dá)比較 PCI前、后24 h、7 d、30 d比較，T2DM組患者TLR3蛋白表達(dá)水平低于非T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.97±0.17vs. 1.15±0.29）、（1.38±0.15vs. 1.74±0.32）、（1.82±0.16vs.2.07±0.19）、（2.19±0.41vs. 2.65±0.78），P＜0.05]，TLR4蛋白表達(dá)水平高于非T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.51±0.25vs. 1.27±0.39）（1.38±0.27vs. 1.06±0.15）、（0.98±0.46vs.0.69±0.39）、（0.72±0.15vs. 0.48±0.31），P＜0.05]；行PCI術(shù)后，兩組患者TLR3蛋白表達(dá)水平均隨著術(shù)后時(shí)間的延長呈增高趨勢（P＜0.05）、TLR4蛋白表達(dá)水平均呈降低的趨勢（P＜0.05），見表5。

表4 兩組患者PCI術(shù)前、術(shù)后TLR3、TLR4 mRNA水平比較

2.5 兩組患者外周血IL-10、TNF-α含量比較PCI前、后24 h、7 d、30 d比較，T2DM組患者外周血中IL-10水平低于非T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（70.59±13.18vs. 80.64±14.15）pg/ml、（90.92±10.95vs. 98.76±9.87）pg/ml、（127.68±14.09vs. 136.94±13.16）pg/ml、（210.53±11.10vs. 231.48±13.21）pg/ml，P＜0.05]，TNF-α水平高于非T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（41.23±5.94vs. 38.67±5.92）pg/ml、（32.19±4.97vs. 29.51±5.31）pg/ml、（19.65±3.59vs.17.19±3.58）pg/ml、（12.21±2.54vs. 10.48±3.11）pg/ml，P＜0.05]；行PCI后，兩組患者外周血IL-10水平均隨著術(shù)后時(shí)間的延長呈增高趨勢（P＜0.05）、TNF-α水平均呈降低的趨勢（P＜0.05），見表6。

2.6 兩組患者術(shù)后主要不良心臟事件比較 兩組患者術(shù)后1年隨訪結(jié)果顯示，與非T2DM組比較，T2DM組患者Q波心肌梗死、非Q波心肌梗死、心絞痛、死亡等不良心臟事件的發(fā)生概率高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。T2DM組不良心臟事件總發(fā)生率28.21%高于非T2DM組9.80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024），見表7。

表5 兩組患者PCI術(shù)前、術(shù)后TLR3、TLR4 mRNA水平比較

表6 兩組患者PCI術(shù)前、術(shù)后外周血中IL-10、TNF-α水平比較

2.7 影響PCI術(shù)后主要不良心臟事件的因素分析 將PCI術(shù)后不良心臟事件（有=1，無=0）作為因變量，將血糖值，病變程度、病變數(shù)目，血脂及外周血IL-10、TNF-α、TLR3、TLR4蛋白水平作為自變量進(jìn)行多因素Logistics回歸分析顯示，血糖（OR=2.645，95%CI：1.726～3.694；P=0.035）、病變數(shù)目（OR=3.421，95%CI：1.358～4.489；P=0.016）及IL-10（OR=2.854，95%CI：1.863～3.967；P=0.017）、TLR3（OR=3.682，95%CI：2.362～6.951；P=0.031）、TLR4（OR=4.157，95%CI：2.638～10.417；P=0.001）是影響PCI術(shù)后不良心臟事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

表7 兩組患者術(shù)后主要不良心臟事件比較（n，%）

表8 影響PCI術(shù)后不良心臟事件的因素分析

近年來，我國心腦血管疾病發(fā)病率快速增加，冠心病因其高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響我國公民的身體健康和生命安全，給家庭和社會(huì)造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。糖尿病能促進(jìn)心血管發(fā)生炎癥反應(yīng)，是冠心病的危重癥[8]。研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致冠心病患者PCI后發(fā)生不良心臟事件的重要原因[9]。本研究通過檢測冠心病合并糖尿病患者PCI術(shù)后TLR3、TLR4、IL-10、TNF-α的水平及變化，同時(shí)探討它們與PCI后不良心臟事件發(fā)生的相關(guān)性。

Toll樣受體在樹突狀細(xì)胞、白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá)，作為先天免疫受體和模式識(shí)別受體識(shí)別[10]。一些TLR，如TLR4與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，參與冠心病、糖尿病等多種炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展[11,12]。大量研究證明TLR4可作為CAD的治療靶點(diǎn)[13,14]。Jialal等[15]發(fā)現(xiàn)，T1DM和T2DM患者中TLR2、TLR4表達(dá)水平明顯上調(diào)，其下游炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6，單核細(xì)胞趨化蛋白-1和1型干擾素活性也明顯上調(diào)，推測TLR2、TLR4能通過促進(jìn)血管中炎癥反應(yīng)促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。Cole等[16]發(fā)現(xiàn)，TLR3的基因缺失加速高膽固醇ApoE（-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，推測TLR3具有保護(hù)血管作用。Shao等[17]發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中TLR3表達(dá)水平顯著下調(diào)，TLR4表達(dá)水平明顯上調(diào)，推測TLR3作為抗炎癥因子，TLR4作為促炎癥因子共同參與CAD發(fā)生、發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)PCI前、后同一時(shí)間點(diǎn)，T2DM組患者TLR3表達(dá)水平低于非T2DM組患者，TLR4表達(dá)水平高于非T2DM組患者。行PCI后，兩組患者TLR3表達(dá)水平呈增高趨勢，TLR4表達(dá)水平呈降低趨勢，提示TLR3和TLR4在動(dòng)脈疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著相反的作用，合并糖尿病能影響患者PCI術(shù)后外周血中TLR3、TLR4表達(dá)水平。

白細(xì)胞介素是一種細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化，參與炎癥反應(yīng)[18]。腫瘤壞死因子是一種能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞，具有較強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞因子[19]。IL、TNF作為TLR3、TLR4信號(hào)途徑的下游因子，參與調(diào)節(jié)血管中炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)冠心病、糖尿病等炎癥疾病的發(fā)生[20]。研究發(fā)現(xiàn)[21-23]IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α的基因多樣性與T2DM的發(fā)生密切相關(guān)。Dopheide等[24]發(fā)現(xiàn)，IL-10/ TNF-α比值較低的CAD患者左心室射血分?jǐn)?shù)較低，十年內(nèi)不良心臟事件發(fā)生率較高，推測IL-10、TNFα不平衡可能與動(dòng)脈粥樣硬化和心力衰竭等病理過程相關(guān)。Shao等[25]發(fā)現(xiàn)，PCI后冠心病患者TLR3及其下游炎癥因子IL-10、INF-β、IRF-3表達(dá)水平顯著下調(diào)，TLR4及其下游炎癥因子MyD88、TNF-α表達(dá)水平明顯上調(diào)，推測TLR3、TLR4誘導(dǎo)的IL-10、TNF-α等炎癥因子失調(diào)是影響PCI術(shù)預(yù)后的因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)前、術(shù)后，T2DM組患者IL-10水平低于非T2DM組，TNF-α水平高于非T2DM組。提示合并糖尿病可能導(dǎo)致冠心病患者外周血中IL-10含量降低，TNF-α含量增加。兩組患者術(shù)后1年隨訪結(jié)果顯示，T2DM組不良心臟事件總發(fā)生率高于非T2DM組。提示合并糖尿病可能影響冠心病患者PCI預(yù)后情況。多因素logistic回歸分析顯示，影響PCI術(shù)后不良心臟事件的因素有血糖、病變數(shù)目及IL-10、TLR3、TLR4，表明糖尿病，TLR3、IL-10、TLR4是影響冠心病合并糖尿病患者PCI術(shù)預(yù)后的因素。

綜上所述，TLR4、TNF-α在冠心病合并糖尿病患者外周血中高表達(dá)，TLR3、IL-10低表達(dá)，T2DM組不良心臟事件總發(fā)生率高于非T2DM組，TLR3、IL-10、TLR4、TNF-α可能影響冠心病合并糖尿病患者PCI術(shù)預(yù)后，但是由于本研究為回顧性分析，納入樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，影響冠心病合并糖尿PCI術(shù)預(yù)后的具體機(jī)制較多，因此還需要大樣本、前瞻性、多方面的深入研究。

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