王建發(fā)，趙國安

心肌梗死（MI）指冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷，使部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死[1]。臨床主要表現(xiàn)為劇烈而持久的胸骨后疼痛，發(fā)熱、白細(xì)胞增多、血清心肌酶活力增高及進(jìn)行性心電圖變化等，可導(dǎo)致心律失常、休克或心力衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。MI的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜多樣，目前針對其治療方法包括調(diào)整生活方式、藥物控制及手術(shù)治療等，但調(diào)整生活方式耗時(shí)且收效甚微、西藥長期治療毒副作用大及手術(shù)創(chuàng)傷性大等不足，嚴(yán)重阻礙MI患者的治療和預(yù)后。在此背景下，中醫(yī)藥針對心血管疾病防治的多途徑、多靶點(diǎn)及整體調(diào)節(jié)的治療方針優(yōu)勢凸顯[3,4]。本研究通過探討芍藥苷對MI大鼠的保護(hù)作用，并初步探究其中所涉及的相關(guān)分子機(jī)制，為臨床MI的治療方法提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD大鼠，64只，雌雄各半，體質(zhì)量240～280 g，合格證號：SCXK-(吉)2003-0001，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18～22℃、相對濕度40%～50%，標(biāo)準(zhǔn)飼料和水飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 鹽酸異丙腎上腺素注射液，CAS號：51-30-9，規(guī)格：1 mg，廠家：湖北廣奧生物科技有限公司；纈沙坦膠囊，國藥準(zhǔn)字：H20040217，規(guī)格：80 mg，廠家：北京諾華制藥有限公司；芍藥苷，純度≥90%，批號：20140912，廠家：寧波德康生物制品有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Western blot印跡全套試劑盒，購于上海西寶生物科技有限公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；cAMP 、PKA、pPKA ELISA試劑盒，均購自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建造 SD大鼠均參照文獻(xiàn)[5,6]采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支構(gòu)建大鼠心肌梗死模型：①以水合氯醛腹腔注射350 mg/kg進(jìn)行麻醉，麻醉滿意后將大鼠以仰位固定；②對大鼠氣管進(jìn)行插管建立呼吸輔助通道；③手術(shù)區(qū)備皮，消毒，開胸并暴露心臟；④結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支：撕開心包膜后，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，距主動(dòng)脈根部2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。⑤關(guān)胸，清除腹腔內(nèi)積血，連接縫合肋間肌，并通過擠壓大鼠胸壁排出胸腔內(nèi)氣體，恢復(fù)胸腔負(fù)壓狀態(tài)，迅速閉合胸腔，縫合，消毒。⑥斷開呼吸機(jī)，大鼠自主呼吸穩(wěn)定后拔管，清理呼吸道，單籠喂養(yǎng)。結(jié)扎后左室壁蒼白或變紫，并出現(xiàn)活動(dòng)減弱，心電圖ST段抬高，表明結(jié)扎成功。另取10只SD大鼠作為假手術(shù)組，不結(jié)扎，其余步驟同上。手術(shù)3 h后，腹腔注射3.5 ml/kg水合氯醛，使其全身麻醉，穩(wěn)定5 min后，以Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)采集大鼠心電圖信號并傳入電腦，記錄假手術(shù)組與造模組大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖中ST段的變化。造模過程中4只大鼠因麻藥過量導(dǎo)致造模失敗。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 將建模成功后大鼠隨機(jī)分為陽性對照組（以10 mg/kg纈沙坦灌胃給藥），芍藥苷低、中、高劑量組（分別以25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg灌胃給藥），模型組及假手術(shù)組（以等量生理鹽水灌胃），1/d，連續(xù)給藥4周。

1.2.3 樣本采集 給藥4周后，于腹主動(dòng)脈采血，3500 r/min離心15 min，分離血清，存于-80℃冰箱中備用；取血結(jié)束后，以靜注氯化鉀處死大鼠，打開胸腔，取出心臟，心臟標(biāo)本以4%甲醛固定，石蠟包埋，備用。

1.2.4 各組大鼠血清酶學(xué)變化的檢測 檢測血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力變化，實(shí)驗(yàn)步驟分別按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.5 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化 取石蠟包埋的心肌標(biāo)本，切片，每個(gè)標(biāo)本取3～5張不連續(xù)的切片；常規(guī)脫蠟處理后，加蘇木素染液5 min后，水洗；分別再以鹽酸乙醇-氨水處理；以酸化伊紅乙醇復(fù)染，自來水終止染色；以梯度酒精進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明后中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察心肌組織的病理變化。

1.2.6 各組大鼠心肌梗死面積的測定 參照文獻(xiàn)[7]方法，在做冠狀動(dòng)脈結(jié)扎點(diǎn)以下垂直于長軸橫斷片段切片，切片厚度4 μm，以Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算心肌梗死面積（IS），梗死面積（%）=[(左心室梗死部位心內(nèi)膜長/總心內(nèi)膜周長)/2]+[(左心室梗死部位心外膜長/總心外膜長)/2]×100 %。

1.2.7 各組大鼠心肌組織中cAMP、PKA及pPKA表達(dá)檢測 Western blot檢測大鼠心肌組織中cAMP、PKA及pPKA蛋白表達(dá)，血管總蛋白的提取：取大鼠的心肌組織于研缽中，加入300 UI裂解液（按照說明書配制1 mmol/L的PMSF），于冰上進(jìn)行研磨10 min、充分振蕩并靜置10 min后，在4℃以14000 r/min離心8 min，取上清即得總蛋白；以BCA法檢測蛋白濃度，分別取60 μg總蛋白，以5倍量上揚(yáng)緩沖液稀釋后，置于95℃變性5 min，備用；Western blot檢測：將變性蛋白置于120 g/L的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，而后分別加入一抗cAMP、PKA及pPKA于4℃孵育過夜，再以辣根過氧化酶結(jié)合的山羊抗兔孵育后，采用BeyoECL Plus 發(fā)光檢測。檢測完畢進(jìn)行免疫印跡清除，再檢測β-actin，方法同上。一圖像分析軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反應(yīng)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.8 各組大鼠心肌組織中pCREB蛋白表達(dá)檢測采用免疫組化法檢測大鼠心肌組織中pCREB蛋白表達(dá)情況：將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水、枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，同時(shí)采用H2O23%漂洗，將內(nèi)源性過氧化酶活性去除；接著采用triton 4%在4℃下孵育24 h、山羊血清封閉，37℃孵育20 min。甩去封閉血清后，滴加1:800的pCREB一抗、二抗，HRP、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸分化3 s、碳酸鋰30 s泛藍(lán); 逆濃度酒精脫水、封片前二甲苯透明15 min、中性樹脂封片。最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件對本研究中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 假手術(shù)組與造模組心電圖對比

表1 各組血清酶學(xué)指標(biāo)測定（±s）

表1 各組血清酶學(xué)指標(biāo)測定（±s）

注：LDH：乳酸脫氫酶；CK：肌酸激酶，SOD：超氧岐化酶；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與陽性對照組比較，dP＜0.05

組別 樣本量（n） LDH（U/ml） CK（U/ml） SOD（U/ml）假手術(shù)組 10 8.34±0.53 6.45±0.34 69.27±7.31模型組 10 23.65±2.47a 14.72±1.48a 48.01±5.69a陽性對照組 10 13.34±1.15c 9.32±1.34c 57.35±3.58c芍藥苷低劑量組 10 19.47±2.53b 12.36±1.36b 52.64±2.67b芍藥苷中劑量組 10 14.21±1.32c 10.69±1.07c 55.97±1.34c芍藥苷高劑量組 10 10.54±0.64cd 7.34±0.12cd 64.58±4.59cd

表2 各組大鼠心肌梗死面積的比較

表3 各組大鼠血漿中cAMP表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠血漿中cAMP表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與陽性對照組比較，dP＜0.05

組別 樣本量（n） cAMP（nmol/L）假手術(shù)組 10 35.72±4.21模型組 10 16.72±2.53a陽性對照組 10 24.67±3.38c芍藥苷低劑量組 10 20.97±2.49b芍藥苷中劑量組 10 26.37±4.15c芍藥苷高劑量組 10 32.72±3.49cd

圖2 各組心肌組織形態(tài)學(xué)變化（×200）

2 結(jié)果

2.1 假手術(shù)組與造模組大鼠心電圖變化 假手術(shù)組心電圖各導(dǎo)聯(lián)無ST段變化，造模組心電圖中導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高，提示MI模型造模成功，可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

2.2 各組大鼠血清酶學(xué)變化測定 給藥4周后，各治療組大鼠血清中CK、LDH活性均顯著降低（P＜0.05），SOD活性均顯著升高（P＜0.05）；隨芍藥苷劑量的增加，血清中CK、LDH活性均逐漸降低，SOD活性逐漸升高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且芍藥苷高劑量組血清CK指標(biāo)接近假手術(shù)組（表1）。

2.3 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化測定 假手術(shù)組心肌細(xì)胞完整，細(xì)胞核基本無變化；模型組心肌損傷明顯，細(xì)胞核固縮或碎裂，部分細(xì)胞核溶解，心肌細(xì)胞壞死。各給藥組病例癥狀均有改善，且陽性對照組及芍藥苷中、高劑量組改善明顯（圖2）。

2.4 各組MI面積的測定 給藥4周后，各治療組大鼠MI面積均明顯減?。浑S芍藥苷劑量增加，MI面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.5 各組心肌組織中cAMP表達(dá)水平的測定 給藥4周后，各治療組大鼠心肌組織中cAMP的表達(dá)水平均顯著上調(diào)；隨芍藥苷劑量的增加，cAMP的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；芍藥苷高劑量組cAMP的表達(dá)水平接近假手術(shù)組（表3）。

2.6 各組心肌組織中PKA/pPKA表達(dá)水平的測定給藥4周后，各組間PKA表達(dá)水平均無顯著性差異（P＞0.05）；各治療組大鼠心肌組織中pPKA的表達(dá)水平均顯著上調(diào)；隨芍藥苷劑量的增加，pPKA的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且芍藥苷高劑量組PKA的表達(dá)水平接近假手術(shù)組（表4、圖3）。

2.7 各組心肌組織中pCREB蛋白表達(dá)水平的測定 給藥4周后，各治療組大鼠心肌組織中pCREB蛋白的表達(dá)水平均顯著上調(diào)；隨芍藥苷劑量的增加，pCREB蛋白的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；芍藥苷高劑量組pCREB蛋白表達(dá)明顯高于陽性對照組和模型組（P＜0.05）（表5）。

表4 各組大鼠心肌組織中PKA表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中PKA表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與陽性對照組比較，eP＜0.05

組別 樣本量（n） PKA/β-actin pPKA/β-actin假手術(shù)組 10 0.68±0.09 0.82±0.12模型組 10 0.64±0.12 0.35±0.02b陽性對照組 10 0.65±0.07 0.63±0.03d芍藥苷低劑量組 10 0.71±0.08 0.41±0.05c芍藥苷中劑量組 10 0.69±0.06 0.67±0.05d芍藥苷高劑量組 10 0.72±0.05 0.78±0.04de

圖3 各組大鼠心肌組織中PKA蛋白表達(dá)量變化

表5 各組心肌組織中pCREB蛋白表達(dá)水平

3 討論

MI是臨床內(nèi)科常見的危急重癥，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整及人口老齡化的影響，MI的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增高的趨勢，且其居高不下的死亡率給患者及家庭帶來極大威脅[8]。臨床針對MI診斷主要是通過觀察心電圖、測定血清酶學(xué)中相關(guān)指標(biāo)（如CK、LDH、SOD等）變化[9]、病理學(xué)檢查及MI面積的觀察等手段，故針對臨床療效的評價(jià)同樣可以以這些指標(biāo)的變化作為參考。

目前西醫(yī)主要認(rèn)為MI發(fā)病是冠狀動(dòng)脈硬化、血栓形成導(dǎo)致血管堵塞，使心肌嚴(yán)重缺血缺氧所致[10]；中醫(yī)則將其歸屬為“真心痛”、“胸痹”、“厥心痛”的范疇，屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛是指氣、血、陰、陽虧虛；標(biāo)實(shí)是指血瘀、痰濁、寒凝、氣滯等證，其中以氣虛痰瘀為主要病理機(jī)制[11,12]。對應(yīng)的治療原則亦有所差異：西藥雖在治療疾病時(shí)具有起效快速的特點(diǎn)，但針對MI疾病特點(diǎn)，所需治療病程長、服藥量大，西藥無法兼顧整體且副作用大的缺點(diǎn)，導(dǎo)致其在臨床MI的治療方面遜色于中醫(yī)藥治療。中醫(yī)藥針對MI的治療，從病機(jī)出發(fā)，多采用益氣活血祛瘀之法，且中藥及其復(fù)方針對MI的治療具有多層次、多靶點(diǎn)、多途徑綜合作用的優(yōu)勢，使得中藥治療MI逐漸成為臨床治療MI的首選。

芍藥苷是從毛茛科植物芍藥中提取出的單帖糖苷類單體成分，為芍藥根中的生物活性成分，近年來國內(nèi)外學(xué)者對芍藥苷的心血管方面的藥理作用進(jìn)行了大量深入的研究，發(fā)現(xiàn)其對心肌缺血所致的心肌損傷具有保護(hù)作用，且療效顯著[13]，但其具體作用機(jī)理仍待進(jìn)一步研究。于蓓等研究表明，芍藥苷可能通過穩(wěn)定細(xì)胞膜、抑制心肌損傷、降低脂質(zhì)的過氧化等發(fā)揮對心肌損傷的保護(hù)作用[14]。而本研究結(jié)果顯示，治療后隨芍藥苷劑量的增加，血清中CK、LDH活性均逐漸降低，SOD活性均逐漸升高，明顯減輕心肌細(xì)胞壞死癥狀，MI面積顯著減?。≒＜0.05），此結(jié)果證明芍藥苷預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。另外王微等研究結(jié)果表明，通過芍藥苷預(yù)處理對大鼠心肌缺血的保護(hù)機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB的蛋白表達(dá)有關(guān)[15]。郝霽萍等研究表明，芍藥苷可能通過促進(jìn)PPARα的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制血清中TNF-α、ICAM-1的含量減輕缺血心肌的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對心肌組織的保護(hù)作用[16,17]。高宇勤等研究表明，芍藥苷可能通過上調(diào)AMPKα的表達(dá)水平，促進(jìn)其磷酸化，進(jìn)而減輕心肌損傷[18]。上述研究表明芍藥苷可通過多途徑、多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對損傷心肌的保護(hù)。

cAMP-PKA信號通路為最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)之一，經(jīng)國內(nèi)外大量研究表明，其通路的信息傳遞過程主要包括：外部信號通過結(jié)合細(xì)胞膜上特異性受體，激活G-蛋白及腺苷酸活化酶，進(jìn)而促進(jìn)三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP通過促進(jìn)PKA將特異性的蛋白質(zhì)磷酸化為pPKA，引起細(xì)胞效應(yīng)[19]。pCREB是CREB蛋白的磷酸化形式，同時(shí)也是cAMP-PKA信號通路的主要下游蛋白，pCREB在正常大鼠中蛋白表達(dá)量較少，其主要位于細(xì)胞核內(nèi)，核仁染色呈現(xiàn)棕黃色。Inserte等研究結(jié)果表明，心肌組織中cAMP水平升高，促進(jìn)pPKA的激活，進(jìn)而通過心肌細(xì)胞中的Ca2+通道產(chǎn)生對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[20]。韓勁松等研究表明，二氮嗪可能通過cAMP-PKA信號通路的調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)對心肌細(xì)胞的保護(hù)[21]。Zhang等研究普萘洛爾對損傷心肌保護(hù)作用機(jī)制，表明通過cAMP-PKA信號通路可調(diào)控對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[22]。本研究通過cAMP-PKA信號通路對MI大鼠保護(hù)作用進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，心肌組織中PKA表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）；但cAMP及pPKA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，以上研究結(jié)果表明心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制可以通過調(diào)節(jié)cAMP-PKA信號通路進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，各指標(biāo)變化程度均呈劑量相關(guān)性，芍藥苷高劑量組血清激酶指標(biāo)及cAMP、pPKA表達(dá)水平均接近假手術(shù)組，芍藥苷高劑量組pCREB蛋白表達(dá)也明顯高于陽性對照組和模型組，進(jìn)一步證明，高劑量芍藥苷可通過調(diào)節(jié)cAMP-PKA信號通路中的cAMP、PKA及pCREB蛋白表達(dá)增加達(dá)到保護(hù)作用。

綜上所述，芍藥苷對心肌梗死大鼠的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)cAMP-PKA信號通路中的cAMP及PKA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，且治療作用具有劑量相關(guān)性。但其具體的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

參 考 文 獻(xiàn)

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