韓延輝，王燕，賈靜靜，王紅雷，朱繼紅，來利紅，李影

急性心肌梗死是由于患者冠狀動脈發(fā)生急性 閉塞所致相應(yīng)供血區(qū)心肌缺血壞死，是一種發(fā)病率和死亡率較高的疾病[1]。心肌水腫是缺血性心肌梗死常見的并發(fā)癥，臨床研究表明其對心室收縮和舒張功能造成負(fù)面影響，進(jìn)一步增加心律失常、心肌壞死等不良預(yù)后的發(fā)生風(fēng)險，而目前臨床針對心肌梗死后心肌水腫的研究多集中于臨床診斷，對發(fā)病原因及機制的研究較少[2]。水通道蛋白1（AQP1）屬于水通道蛋白家族的一個亞型，在自由水分子跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用，以往研究顯示AQP1、AQP4與腦缺血性水腫密切相關(guān)；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是缺氧條件下產(chǎn)生的DNA結(jié)合蛋白，其作為血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）的活化因子，在缺血性梗死組織中表達(dá)明顯增加，參與血管新生的復(fù)雜病理過程[3,4]。本研究采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支法制備大鼠心肌梗死模型，觀察心肌組織中AQP1、HIF-1α的表達(dá)變化，探討其與心肌水腫的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南省實驗動物中心，均適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，喂養(yǎng)條件適中（溫度22℃、相對濕度60%、自由飲水、按量飲食）。

1.2 儀器與試劑 主要儀器包括全波長Multiskan FC 型酶標(biāo)儀購自Thermo Scientific公司；Microfuge R型離心機購自Beckman公司；Mastercycler nexus PCR儀購自Eppendorf公司；7500型熒光定量檢測儀購自Applied Biosystems公司；TE214S型分析天平購自Sartorius公司。主要試劑包括AQP1、HIF-1α雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫實驗（ELISA）檢測試劑盒購自R&D Systems公司；TRIZOL? Reagent Cat購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription Kit和熒光定量檢測試劑盒SYBR?Premix Ex Taq?均購自日本Takara公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 動物模型建立及分組 將48只SD大鼠隨機分為心肌梗死組和假手術(shù)組，每組24只。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，注射量為4 ml/kg，麻醉后進(jìn)行氣管插管，在胸骨左側(cè)第3、4肋骨間開胸，然后在左心耳和肺動脈椎線連接的中點下方2 mm處對左側(cè)冠狀動脈進(jìn)行結(jié)扎，以心電圖顯示肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段持續(xù)抬高30 min以上作為梗死模型成功的標(biāo)志[5]。假手術(shù)組手術(shù)方法同梗死組，但只穿線不結(jié)扎冠狀動脈。

1.4 樣本采集 造模完成后12、24、48、72 h分批處理各組大鼠，注射3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）深度麻醉，取出心臟，生理鹽水沖洗，根據(jù)后續(xù)實驗需要進(jìn)行樣品保存。

1.5 心肌組織中AQP1、HIF-1α蛋白檢測 采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫實驗（ELISA）檢測心肌組織勻漿液中AQP1、HIF-1α蛋白的含量。取各時間點心肌組織勻漿，勻漿完成后3000 rpm離心10 min，取上清進(jìn)行ELISA檢測，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，為減少實驗誤差，各樣本均重復(fù)測量3次后取平均值。

1.6 Real-time PCR檢測心肌組織中AQP1、HIF-1α mRNA水平 取各時間點心肌組織標(biāo)本0.1 g，假手術(shù)組取相同解剖部位心肌組織，用剪刀剪碎，采用Trizol法提取組織中的總RNA，通過Reverse Transcription Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用熒光定量試劑盒SYBR? Premix Ex Taq?對心肌組織中的AQP1、HIF-1α mRNA進(jìn)行測定，檢測總體系為25 μl，其中上下游引物各0.5 μl、2×SYBR? Premix 12.5 μl，cDNA模板2 μl、ddH2O 9.5 μl，PCR程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測：95℃預(yù)變性30s，（95℃ 5s，60℃30s）共40個循環(huán)，溶解曲線為95℃ 15s、60℃60s、95℃ 15s。以GADPH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量，各基因擴增的上下游引物序列見表1。

表1 AQP1、HIF-1α、GADPH的引物序列

1.7 心肌組織含水量檢測 在各檢測時間點，取處死后的大鼠心臟，去除心臟、大血管、右心室及其他用于勻漿和提取RNA的組織樣本后，在分析天平上對原始重量進(jìn)行稱量即為濕重，在80℃條件下干燥24 h后對左心室進(jìn)行再次稱量即為干重，組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對本研究所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD法，方差非齊次時采用Dunnett’s T3法，AQP1、HIF-1α與心肌水腫的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠心肌組織AQP1、HIF-1α mRNA表達(dá)情況 心肌梗死組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α mRNA水平較假手術(shù)組明顯升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；且心肌梗死組大鼠心肌組織AQP1、HIF-1α mRNA水平隨時間呈增高趨勢，各時間點組間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

2.2 兩組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α蛋白表達(dá)情況 心肌梗死組大鼠心肌組織AQP1、HIF-1α的蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；心肌梗死組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平均在72 h內(nèi)呈時間梯度升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表2 兩組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

表2 兩組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=6）

注：AQP1：水通道蛋白1；HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05

組別 蛋白 12 h 24 h 48 h 72 h F值 P值假手術(shù)組 AQP1 0.98±0.05 0.97±0.03 0.98±0.04 0.96±0.05 0.293 0.830 HIF-1α 0.59±0.01 0.58±0.03 0.60±0.02 0.58±0.04 0.629 0.605心肌梗死組 AQP1 1.12±0.05a 1.19±0.04a 1.26±0.03a 1.30±0.05a 20.133 ＜0.01 HIF-1α 0.70±0.03a 0.76±0.02a 0.85±0.04a 0.89±0.04a 27.323 ＜0.01

2.3 兩組大鼠不同時間點心肌水腫情況 心肌梗死組大鼠術(shù)后12、24、48、72 h心肌組織含水量逐漸升高，與假手術(shù)組比較也升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表4）。

2.4 心肌梗死大鼠心肌組織中AQP1 mRNA及蛋白水平與心肌水腫的相關(guān)性 心肌梗死大鼠心肌組織中AQP1 mRNA水平與心肌含水量呈正相關(guān)（r=0.507，P=0.010），AQP1蛋白水平與心肌含水量呈正相關(guān)（r=0.585，P=0.008）（圖1～2）。

2.5 心肌梗死大鼠心肌組織中HIF-1α mRNA及蛋白水平與心肌水腫的相關(guān)性 心肌梗死大鼠心肌組織中HIF-1α mRNA水平與心肌含水量呈正相關(guān)（r=0.408，P=0.025），HIF-1α蛋白水平與心肌含水量呈正相關(guān)（r=0.486，P=0.017）（圖3～4）。

表3 兩組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較（ng/ml，±s，n=6）

表3 兩組大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較（ng/ml，±s，n=6）

注：AQP1：水通道蛋白1；HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05

組別 蛋白 12 h 24 h 48 h 72 h F值 P值假手術(shù)組 AQP1 19.50±1.75 19.27±1.72 20.45±2.55 20.30±3.12 0.366 0.778 HIF-1α 34.57±2.46 35.29±3.42 35.16±2.75 36.05±2.12 0.298 0.826心肌梗死組 AQP1 29.35±3.52a 33.52±2.87a 38.65±4.63a 45.81±5.05a 17.862 ＜0.01 HIF-1α 49.25±5.36a 53.47±6.72a 60.58±5.36a 62.30±6.08a 6.418 0.003

表4 兩組大鼠各時間點心肌組織含水量比較（%，±s，n=6）

表4 兩組大鼠各時間點心肌組織含水量比較（%，±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05

組別 12 h 24 h 48 h 72 h F值 P值假手術(shù)組 70.21±0.48 70.32±0.56 70.39±0.46 70.36±0.52 0.145 0.932心肌梗死組 73.23±0.79a 74.12±1.16a 76.23±1.57a 78.75±1.75a 19.341 ＜0.01

圖1 心肌梗死大鼠心肌組織含水量與AQP1mRNA表達(dá)的相關(guān)性

圖2 心肌梗死大鼠心肌組織含水量與AQP1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

心肌水腫是急性心肌梗死后常見的病理改變，冠狀動脈閉塞后心肌處于缺血缺氧環(huán)境，有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧酵解，相關(guān)細(xì)胞因子在局部聚集，導(dǎo)致該區(qū)域組織間質(zhì)通透性發(fā)生變化，心肌細(xì)胞外水分子向胞內(nèi)移動并滯留于細(xì)胞內(nèi)；同時缺氧環(huán)境會抑制心肌細(xì)胞膜上腺苷三磷酸酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部處于高滲狀態(tài)，引發(fā)水腫[6]。缺血后心肌水腫會使左心室功能障礙甚至結(jié)構(gòu)改變，降低其順應(yīng)性，是影響患者預(yù)后的主要因素之一[7]。

AQP1是廣泛表達(dá)于腎臟、肺部、腦部及心臟等的水通道蛋白。生理條件下AQP1蛋白對水分子的跨膜轉(zhuǎn)運影響并不明顯。但相關(guān)研究顯示在病理狀態(tài)下細(xì)胞膜上水分子的轉(zhuǎn)運多以AQP通道為主，AQP1參與調(diào)節(jié)腦水腫、肺水腫、腫瘤轉(zhuǎn)歸等各種病理過程的水代謝[8,9]。Yan等[10]研究表明AQP1在山羊體外循環(huán)手術(shù)后高表達(dá)，與心肌水腫程度密切相關(guān)，敲除AQP1基因后，水腫程度明顯降低；李志清等[11]研究表明在大鼠燙傷早期心肌組織中AQP-1 mRNA表達(dá)量與心肌組織含水率、血清cTnI含量均呈顯著正相關(guān)；閆玉梅等[12]研究顯示在AQP1慢病毒載體轉(zhuǎn)染羊心肌組織后，體外循環(huán)結(jié)束后48 h內(nèi)AQP1 mRNA水平和蛋白水平趨勢相同，且轉(zhuǎn)染組水腫程度更為嚴(yán)重，AQP1水平與心肌水腫程度呈正相關(guān)。HIF-1α是細(xì)胞在缺氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的核蛋白。臨床研究表明其主要受上游ERK/MAPK、PI3K/AKT/mTOR等通路的調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶、VEGF等基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成[13]。李敏等[14]研究顯示在膝骨關(guān)節(jié)炎伴骨髓水腫患者血清HIF-1α、VEGF水平明顯高于非骨髓水腫組，且與患者骨髓水腫的容積積分、程度積分均呈正相關(guān)。但目前尚未有HIF-1α是否介導(dǎo)心肌梗死后心肌水腫病理進(jìn)程的相關(guān)研究。靳春杰等[15]研究表明HIF-1α在炎癥、缺血性組織及缺氧條件下均呈高表達(dá)，能夠上調(diào)VEGF及炎性抑制TNF-α、IL-1β等的表達(dá)；李玲萍等[16]研究顯示HIF-1α在急性心肌梗死患者中表達(dá)明顯升高且與心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）呈正相關(guān)。本研究對急性心肌梗死大鼠造模后不同時間點的心肌含水量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在術(shù)后12 h即表現(xiàn)水腫，且隨著時間推移水腫程度增加，同時觀察到心肌組織中AQP1和HIF-1α均呈高表達(dá)，且變化趨勢與心肌水腫程度密切相關(guān)，提示，由AQP1介導(dǎo)的跨膜水轉(zhuǎn)運，以及與HIF-1α相關(guān)的炎癥等信號通路，均可能參與心肌梗死后心肌水腫。

綜上所述，心肌梗死大鼠心肌組織中AQP1、HIF-1α mRNA及蛋白均表達(dá)上調(diào)，且在冠狀動脈結(jié)扎后72 h內(nèi)呈時間遞增，且與心肌水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

圖3 心肌梗死大鼠心肌組織含水量與HIF-1α mRNA表達(dá)的相關(guān)性

圖4 心肌梗死大鼠心肌組織含水量與HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性

參 考 文 獻(xiàn)

[1]王娟,劉宏斌. 急性心肌梗死標(biāo)記物的研究進(jìn)展[J]. 中華老年心腦血管病雜志,2016,18(11):1213-6.

[2]Tahir E,Sinn MR,Radunski UK,et al. Serial native T1- and T2-mapping to quantitatively monitor resorption of myocardial edema following acute myocardial infarction[J]. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance,2015,17(1):1-2.

[3]Akdemir G,Kaymaz F,Gursoy-?zdemir Y,et al. The time course changes in expression of aquaporin 4 and aquaporin 1 following global cerebral ischemic edema in rat[J]. Surg Neurol Int, 2016,7(1):4.

[4]戴宇翔,王審,李晨光,等. 梗死心肌側(cè)枝血管形成與缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮生長因子A表達(dá)水平的關(guān)系及臨床意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2015,22(3):305-9.

[5]王浩宇,陳玉成,曾智,等. Aquaporin-1蛋白在缺血心肌中表達(dá)變化及其與心肌水腫的關(guān)系[J]. 華西醫(yī)學(xué),2007,22(1):116-9.

[6]王芳,李曉娟,劉鵬飛. 心肌缺血后心肌水腫的磁共振成像研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(13):2421-3.

[7]Fernándezjiménez R,Sánchezgonzález J,Agüero J,et al.Myocardial edema after ischemia/reperfusion is not stable and follows a bimodal pattern: imaging and histological tissue characterization[J].J Am Coll Cardiol,2015,65(4):315-23.

[8]魏曉,李香營,田毅,等. AQP1在心肌缺血組織中的作用[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué),2012,12(2):243-8.

[9]吉春玲,瞿詳,任亦頻,等. 右美托咪定對膿毒癥大鼠心肌組織水通道蛋白-1及炎癥細(xì)胞因子水平的干預(yù)作用[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2014,21(4):266-9.

[10]Yan Y,Huang J,Ding F,et al. Aquaporin 1 plays an important role in myocardial edema caused by cardiopulmonary, bypass surgery in goat[J]. Int J Mol Med,2013,31(3):637-43.

[11]李志清,肖德權(quán),王甲漢,等. 大鼠燙傷早期心肌組織水通道蛋白1表達(dá)及其與心肌水腫的關(guān)系[J]. 中華燒傷雜志,2013,29(3):245-8.

[12]閆玉梅,丁芳寶,梅舉,等. AQP1慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后加重體外循環(huán)后心肌細(xì)胞水腫[J]. 中華胸心血管外科雜志,2012,28(9):540-3.

[13]李繼強. 缺氧誘導(dǎo)因子1α相關(guān)信號通路與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2015, 21(24):4460-4.

[14]李敏,吳俊華,吳曉惠,等. 伴骨髓水腫的膝骨關(guān)節(jié)炎與血管內(nèi)皮因子、缺氧誘導(dǎo)因子1α的相關(guān)性研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2015,9(20):19-21.

[15]靳春杰,方貴龍,權(quán)偉,等. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠炎性反應(yīng)和血管生成因子表達(dá)的影響[J]. 中華創(chuàng)傷雜志,2016,32(9):835-42.

[16]李玲萍,劉艷,王麗月,等. 急性心肌梗死患者血清低氧誘導(dǎo)因子-1α的檢測及臨床意義分析[J]. 中國藥物與臨床,2016,16(8):1093-5.