朱雅蓮 肖學(xué)成 崔開宇 王曉飄

[摘要]目的 建立測定阿達(dá)帕林凝膠中阿達(dá)帕林有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法。方法 采用色譜柱 ORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，以冰醋酸-水（0.1∶100）為流動相A，以乙腈-四氫呋喃（65∶35）為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為100 μl，流速：1.2 ml/min。結(jié)果 阿達(dá)帕林與各雜質(zhì)分離度良好，阿達(dá)帕林凝膠溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，雜質(zhì)A、B、C、D的定量限分別為0.38、0.56、3.75、1.5 ng；檢測限分別為0.11、0.17、1.12、0.45 ng。阿達(dá)帕林在0.0225～0.1125 μg/ml 的濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=9.9714x+0.003906（r=0.9998）。結(jié)論 此方法測定阿達(dá)帕林凝膠中阿達(dá)帕林有關(guān)物質(zhì)簡單可行。

[關(guān)鍵詞]阿達(dá)帕林凝膠；阿達(dá)帕林；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)

[中圖分類號] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）3（c）-0020-05

[Abstract]Objective To establish the HPLC method for determination related substances of Adapalene in Adapalene Gel.Methods Chromatographic column ORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） was used，and the mobile phase A was glacial acetic acid-water （0.1∶100），and the mobile phase B was acetonitrile-tetrahydrofuran （65∶35） to conduct the gradient elution.The wavelength of detection was 270 nm，the temperature of column was 30°C，the sampling amount was 100 μl，and the flow rate was 1.2 ml/min.Results Adapalene was well separated from various impurity.The solution of Adapalene Gel was stable in 12 hours.The limit of quantification of impurity A，B，C and D was 0.38 ng，0.56 ng，3.75 ng and 1.5 ng respectively，and the detection limit was 0.11 ng，0.17 ng，1.12 ng and 0.45 ng.Adapalene showed a good linear relationship between peak area and concentration in the concentration range of 0.0225-0.1125 g/ml，and the regression equation was y=9.9714x+0.003906 （r=0.9998）.Conclusion This method is simple and feasible to determine the related substances of Adapalene in Adapalene Gel.

[Key words]Adapalene Gel；Adapalene；HPLC；Related substances

痤瘡是一種常發(fā)于顏面部的皮膚病，發(fā)病率高，青少年中常見，目前仍未找到有效的根治方法，臨床上常用藥物治療，一般為局部給藥和口服給藥，由于口服治療的藥物均有不同程度的不良反應(yīng)[1]，因此，臨床上主要采用外治法進(jìn)行治療[2]。阿達(dá)帕林屬于第三代維A酸類藥物，對受體的選擇性強(qiáng)，不良反應(yīng)小，在較低的濃度下可達(dá)到治療效果[3]，是外用維A酸類治療痤瘡的一線選擇藥物[4]。常見的劑型為凝膠劑。阿達(dá)帕林凝膠最先由法國高德美國際公司生產(chǎn)，商品名為達(dá)芙文。該藥具有較強(qiáng)的抗炎作用，同時可以調(diào)節(jié)毛囊口角質(zhì)，形成細(xì)胞的分化和增殖，此外還具有抑制皮脂分泌等作用[5]。臨床上用于治療尋常型痤瘡，其治療效果優(yōu)于硫磺制劑、過氧苯甲酰凝膠，與他扎羅汀總療效相似，不良反應(yīng)較輕[6]。同時有研究表明，阿達(dá)帕林凝膠聯(lián)合其他藥物和方法不僅可以治療輕中度痤瘡[7-9]，對治療跖疣、泛發(fā)性扁平疣和毛周角化癥也有很好的療效[10-13]。由于《中國藥典》并未收載阿達(dá)帕林及制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，EP8.0版和USP38版也只有原料藥的標(biāo)準(zhǔn)，因此，為了更好地保證藥品質(zhì)量，通過參考EP8.0版標(biāo)準(zhǔn)[14]和USP38版標(biāo)準(zhǔn)中阿達(dá)帕林原料藥項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)檢測方法及其他相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，對阿達(dá)帕林凝膠中所含的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查和控制。

1 儀器與試劑

1.1儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安）和相應(yīng)的工作站；AUW220D電子分析天平（日本島津）；CSH-1000GSD-1型綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（重慶創(chuàng)測科技有限公司）；ORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 藥品與試劑

阿達(dá)帕林凝膠樣品（由武漢諾安藥業(yè)有限公司試制，批號為20170301、20170302、20170303，規(guī)格為0.1%）；空白輔料樣品（自制，除不含阿達(dá)帕林外，其他成分均與樣品一致）；市售阿達(dá)帕林凝膠（法國高德美國際公司，批號為5051139，商品名為達(dá)芙文）；阿達(dá)帕林對照品（歐洲藥典委員會提供，批號為00DCL6，含量為99.9%）；阿達(dá)帕林雜質(zhì)A（EP）對照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批號為C4X-18091-1607，含量為97.7%）；阿達(dá)帕林雜質(zhì)B（EP）對照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批號為C4X-18092-1702，含量為98%）；阿達(dá)帕林雜質(zhì)C（EP）對照品（歐洲藥典委員會提供，批號為0004OG，含量為100.0%）；阿達(dá)帕林雜質(zhì)D（EP）對照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批號為C4X-18093-1602，含量為98%）；乙腈、四氫呋喃為色譜純，其他試劑均為分析純；純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用ZORBAX SB-Phenyl柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：以冰醋酸-水（0.1∶100）為流動相A，以乙腈-四氫呋喃（65∶35）為流動相B；檢測波長為270 nm；柱溫為30℃；流速1.2 ml/min；進(jìn)樣量100 μl，梯度洗脫見表1。

2.2溶液的制備

2.2.1樣品溶液 取阿達(dá)帕林凝膠約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用2 ml乙腈-四氫呋喃-水（37∶20∶43）（下稱稀釋劑）清洗燒杯2次，合并清洗液至量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。

2.2.2對照溶液 精密量取“2.2.1”溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.3空白輔料溶液 取空白輔料樣品0.625 g，精密稱定，制備方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.2.4系統(tǒng)適用性溶液 取阿達(dá)帕林和雜質(zhì)A、B、C、D適量，加稀釋劑稀釋成含阿達(dá)帕林約為6.25 μg/ml和各雜質(zhì)濃度為0.0375 μg/ml的混合溶液。

2.3專屬性考察

2.3.1 輔料的干擾試驗(yàn) 取空白溶劑、空白輔料、原料藥溶液、自制凝膠溶液各100 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1），結(jié)果顯示空白溶劑、空白輔料對阿達(dá)帕林峰的檢測無干擾。

2.3.2 雜質(zhì)的定位與分離 取阿達(dá)帕林雜質(zhì)A、B、C、D、主成分藥阿達(dá)帕林溶液和系統(tǒng)適用性溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖2），結(jié)果顯示，四個已知雜質(zhì)對主成分的檢測并不干擾，且各雜質(zhì)峰之間的分離度良好，證明此方法可有效分離阿達(dá)帕林與已知雜質(zhì)。

2.4破壞性試驗(yàn)

制劑酸破壞 取阿達(dá)帕林凝膠約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5ml，超聲使均勻分散，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加入1 mol/L的鹽酸溶液l ml，搖勻，避光放置1 h后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml中和，再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑堿破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液l ml，搖勻，避光放置2 h后，用1 mol/L鹽酸溶液1 ml中和，再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑氧化破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加入30%的H2O2 1 ml，搖勻，避光放置23 h后，于80℃水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑高溫破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置100℃水浴中破壞2 h后，冷卻至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

制劑光照破壞 取本品約0.625 g，精密稱定，置燒杯中，加四氫呋喃5 ml，超聲使均勻分散，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置4500Lx±500Lx的強(qiáng)光下照射0.5 h，搖勻，即得。

按上述色譜條件，分別取酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖3～7，結(jié)果表明：①阿達(dá)帕林凝膠的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進(jìn)樣，所產(chǎn)生雜質(zhì)峰與主峰均能基線分離，各降解產(chǎn)物峰之間、各降解產(chǎn)物峰與主峰之間的分離度均符合規(guī)定；②阿達(dá)帕林凝膠在氧化條件和堿性條件下比較穩(wěn)定，在高溫、光照和酸性條件下較為敏感。雜質(zhì)含量的計算方法為面積歸一法。

2.5精密度試驗(yàn)

取“2.2.4”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液，在上述擬定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針。試驗(yàn)結(jié)果表明，在該色譜條件下，主峰及各雜質(zhì)峰的重復(fù)性好，阿達(dá)帕林與雜質(zhì)A、B、C、D的峰面積分別為65.2543、0.5345、0.5345、0.0623、0.2180。RSD均<2.0%，滿足試驗(yàn)要求。

2.6分離度試驗(yàn)

由于雜質(zhì)C 的保留時間與主藥阿達(dá)帕林的出峰時間最接近，因此主要考察阿達(dá)帕林峰與雜質(zhì)C峰之間的分離度。取雜質(zhì)C和阿達(dá)帕林適量加稀釋劑制成每毫升含阿達(dá)帕林約為6.25 μg/ml和雜質(zhì)C濃度約為0.0375 μg/ml的混合溶液，在上述擬定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針。試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)C峰與主峰分離度的平均值為11.07（>4.5），RSD=1.42%，分離度符合要求。

2.7樣品溶液穩(wěn)定性

取本品凝膠（批號20170301）按“2.2.1”項(xiàng)下的測定方法，新配制供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察樣品溶液穩(wěn)定性。結(jié)果，凝膠中雜質(zhì)D峰面積的RSD=1.18 %（n=6），單雜峰面積的RSD=0.52%（n=6），主峰峰面積的RSD=0.07%（n=6），總雜峰面積的RSD=0.12%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下放置12 h穩(wěn)定。

2.8定量限及檢測限的考察

取雜質(zhì)A、B、C、D對照品溶液，經(jīng)稀釋劑逐步稀釋，分別進(jìn)樣進(jìn)行測定，當(dāng)信噪比（S/N）約為10左右時，雜質(zhì)A、B、C、D的定量限分別為0.38、0.56、3.75、1.5 ng。當(dāng)信噪比（S/N）≥3時，雜質(zhì)A、B、C、D的檢測限分別為0.11、0.17、1.12、0.45 ng。

2.9線性關(guān)系的考察

精密稱取阿達(dá)帕林對照品適量，用稀釋劑溶劑稀釋，配成約為0.0225、0.03、0.0375、0.075、0.1125 μg/ml的線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述擬定的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以阿達(dá)帕林的濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以最小二乘法進(jìn)行線性回歸方程計算及相關(guān)系數(shù)，方程式為y=9.9714x+0.003906（r=0.9998）。結(jié)果表明，在0.0225～0.1125 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，阿達(dá)帕林峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.10樣品測定

取批號為20170301、20170302、20170303三批樣品及市售樣品，按樣品溶液的配制方法，經(jīng)上述確定色譜條件檢查，以主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1流動相條件的選擇

根據(jù)EP8.0版中阿達(dá)帕林原料藥項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)檢測方法測定的結(jié)果，其色譜條件對雜質(zhì)A的檢出有影響，考慮到輔料峰與雜質(zhì)A峰保留時間的重合，將色譜條件進(jìn)行調(diào)整， 增加第一步梯度的時間，將原換相時間由2.5 min增加至10 min；同時，增加水相（流動相A）的比例，將比例由50%增高至60%，減小有機(jī)相（流動相B）的比例，由50%降低至40%，以增加雜質(zhì)A峰與輔料峰的分離度。但是，改變條件后，在30～40 min之間有明顯的換相峰，這會影響其他雜質(zhì)及主峰峰形，其原因可能是增加了第1步梯度的時間，并且縮短了第二步梯度換相時間，導(dǎo)致出現(xiàn)換相峰，因此，我們只增加了第一步梯度的時間，其他與EP8.0版有關(guān)物質(zhì)檢測方法保持一致。流動相條件具體見“2.1”，按此條件測定，阿達(dá)帕林和各雜質(zhì)的分離效果較好。

3.2進(jìn)樣濃度的選擇

由于各國藥典并沒有收載阿達(dá)帕林凝膠的檢測方法，根據(jù)USP38版阿達(dá)帕林原料的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，供試品的濃度為2.0 mg/ml，考慮到阿達(dá)帕林凝膠的規(guī)格為0.1%，若采用同一濃度進(jìn)行試驗(yàn)操作，即需取20 g凝膠置10 ml量瓶中，試驗(yàn)操作無法進(jìn)行。根據(jù)凝膠溶解后過濾的可操作性，最終將供試品溶液濃度確定為0.0625 mg/ml。

3.3進(jìn)樣量的選擇

根據(jù)上述溶液濃度的改變，為了滿足系統(tǒng)適用性的試驗(yàn)要求，即系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)C峰的信噪比應(yīng)>10，將進(jìn)樣量由25 μl改變成100 μl。

4 小結(jié)

阿達(dá)帕林屬于第三代維A酸類藥物，對光較為敏感，結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)[18-19]和本文的破壞性試驗(yàn)，應(yīng)于夜間使用，并且避光保存。

凝膠劑是近年來興起的一種新型制劑，方便易制[20]，相較于乳膏使用時的油膩感，凝膠劑更易被患者所接受。但是，由于凝膠常用卡波姆等高分子聚合物，在制備樣品溶液時會遇到過濾稍微困難的問題，目前還未找到合適的解決辦法。

藥物使用的不良反應(yīng)與所含雜質(zhì)的含量有密切的關(guān)系，因此有效控制雜質(zhì)的含量對藥物的使用安全有著至關(guān)重要的作用。目前對阿達(dá)帕林凝膠的有關(guān)物質(zhì)檢測方法并沒有一個很好的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。本文通過HPLC法對阿達(dá)帕林凝膠中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)研究，為研究制定阿達(dá)帕林凝膠有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

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