魏 銘，趙萊昱，楊航宇，吳玉文，李 騰，王紹陽，朱保慶，張柏林,*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；2.中國長城葡萄酒有限公司，河北 張家口 075400）

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum L.），杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，是生長在我國東北大興安嶺和長白山等地區(qū)的一種野生藍(lán)莓[1]，其果實中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如花色苷、有機酸、維生素和微量元素等[2-4]，具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤、保護(hù)視力等多種生理功能[5-8]。篤斯越橘具有含糖量低、含酸量高、不易貯藏等特點，多加工成果干、果醬或果酒等產(chǎn)品消費[9-10]。篤斯越橘果酒的風(fēng)味主要依賴于酒中所含的糖、單寧和酸類物質(zhì)，除此之外其本身及其在釀造過程中所呈現(xiàn)的特殊香氣成分也是篤斯越橘果酒風(fēng)味的主要組成部分。

香氣成分是決定果酒風(fēng)味、品質(zhì)和典型性的重要因素[11-12]。篤斯越橘果酒的香氣組成直接影響其感官品質(zhì)，是構(gòu)成高品質(zhì)篤斯越橘果酒的一個重要指標(biāo)。香氣物質(zhì)的種類、濃度及其和諧程度決定了篤斯越橘果酒的協(xié)調(diào)性、復(fù)雜性和典型性[13]。酵母代謝是產(chǎn)生果酒香氣的途徑之一，并與發(fā)酵基質(zhì)中的氮源關(guān)系密切，氮源同時也是果酒中某些芳香物質(zhì)的前體。目前對篤斯越橘香氣成分的研究已有報道，但是比較不同酵母和不同氮源對篤斯越橘果酒香氣影響的研究較少，且研究品種多集中于栽培藍(lán)莓[14-16]，對篤斯越橘發(fā)酵酒香氣的研究尚不多見。

頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法是目前廣泛用于食品檢驗、大氣分析、生化和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高效檢測技術(shù)，是酒類香氣成分鑒定強有力的分析工具[17-18]。本實驗以篤斯越橘為原料，分別選用釀酒酵母Red Fruit（以下簡稱為RF）和Vintage Red Challenge（以下簡稱為VRC），輔助添加無機氮源磷酸氫二銨（dibasic ammonium phosphate，DAP）和有機氮源NutriStart（以下簡稱為NS）進(jìn)行發(fā)酵，采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分析不同酵母和氮源種類對篤斯越橘發(fā)酵酒香氣品質(zhì)的影響，以期為篤斯越橘果酒的科學(xué)釀造提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母與氮源

酵母和氮源商業(yè)釀酒干酵母RF和VRC 意大利Enartis公司；DAP 天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司；有機氮源酵母營養(yǎng)劑NS 法國Laffort公司。

1.1.2 酒樣

發(fā)酵工藝參考文獻(xiàn)[19]，以大興安嶺野生篤斯越橘為原料進(jìn)行壓榨，在壓榨過程中在線添加SO2，使最終SO2的質(zhì)量濃度為45 mg/L。調(diào)整果汁的糖質(zhì)量濃度為240 g/L，酸度至pH 3.3；分別加入DAP（300 mg/L）或有機氮源酵母營養(yǎng)劑NS（450 mg/L），按0.2 g/L接入活化好的RF和VRC商業(yè)活性釀酒酵母。在室溫條件下（17～23 ℃），采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中進(jìn)行監(jiān)控（測定溫度和比重），當(dāng)比重連續(xù)3 d不下降或還原糖的含量不在發(fā)生變化時，即可認(rèn)為發(fā)酵終止。發(fā)酵結(jié)束后調(diào)整SO2的質(zhì)量濃度至40 mg/L，滿罐封存，用于理化指標(biāo)和香氣成分分析。

1.1.3 試劑

45 種香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；氫氧化鈣、無水碳酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；偏重亞硫酸鉀（分析純） 意大利Enartis公司。

1.2 儀器與設(shè)備

0.9-1.0、1.0-1.1比重計 上海逸川儀器儀表廠；FA 204電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；6890-5975型GC-MS聯(lián)用儀、HP-INNOWax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

依據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、總酚等理化指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.3.2 樣品預(yù)處理

頂空固相微萃取與GC-MS聯(lián)用分析條件參照朱保慶等[20]的方法，稍作修改。取5 mL待測篤斯越橘果酒樣品于15 mL的樣品瓶中，加入1g NaCl，用帶有聚四氟乙烯隔墊的瓶蓋旋緊密封，于40 ℃條件下在磁力攪拌加熱臺上加熱攪拌30 min，用已活化的固相微萃取頭插入樣品瓶頂空處，相同溫度條件下加熱吸附30 min。取下萃取頭后立即在GC進(jìn)樣口于250 ℃條件下解吸8min。

GC-MS條件：采用6890-5975型GC-MS聯(lián)用儀，HP-INNOWax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；熱解吸25 min。升溫程序：40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min。質(zhì)譜接口溫度280 ℃；電子電離源；離子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍20～350 u。每個樣品做2 次平行測定。

1.3.3 定性和定量方法

依據(jù)已有標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時間和質(zhì)譜信息以及NIST 08標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對結(jié)果，采用自動質(zhì)譜解卷積和鑒定系統(tǒng)軟件對化合物進(jìn)行定性。對于已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，利用以混標(biāo)法制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，對于沒有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)，根據(jù)與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.3.4 香氣活性值計算

香氣活性值是評價葡萄酒揮發(fā)性組分對實際香氣貢獻(xiàn)大小所普遍采用的一個指標(biāo)，目前國內(nèi)外已有許多研究應(yīng)用該指標(biāo)對果酒揮發(fā)性組分的香氣貢獻(xiàn)進(jìn)行評價。每種揮發(fā)性組分的香氣活性值為該物質(zhì)的濃度與其嗅覺閾值的比值，本研究中各物質(zhì)的嗅覺閾值和氣味描述均參考文獻(xiàn)[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

每個樣品重復(fù)實驗3 次，結(jié)果以 ±s表示；平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線等通過Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行分析；采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件（SPSS Inc., Chicago,IL, USA）進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件發(fā)酵篤斯越橘果酒的發(fā)酵速率

圖1 各組篤斯越橘果酒的發(fā)酵速率Fig. 1 Fermentation rate curves of bog bilberry wine

如圖1所示，相對密度由比重計直接測定，當(dāng)相對密度連續(xù)3 d不再改變時認(rèn)為發(fā)酵終止。采用RF酵母發(fā)酵的2 組篤斯越橘果酒的發(fā)酵速度明顯快于采用VRC酵母發(fā)酵的2 組篤斯越橘果酒；RF酵母發(fā)酵的2 組酒樣發(fā)酵曲線較為相似，均在14 d左右發(fā)酵終止；VRC酵母發(fā)酵的2 組酒樣中，采用DAP氮源的發(fā)酵速度稍快于采用NS氮源的酒樣。

2.2 不同條件發(fā)酵篤斯越橘果酒的理化指標(biāo)

表1 不同酵母和氮源發(fā)酵篤斯越橘果酒的理化指標(biāo)Table 1 Characteristics of bog bilberry wines fermented with different yeast species and nitrogen sources

如表1所示，發(fā)酵酒的還原糖受氮源種類影響較大，使用無機氮源的2 種處理（RF＋DAP和VRC＋DAP）顯著低于使用有機氮源的處理（RF＋NS和VRC＋NS）。與有機氮相比，無機氮容易被酵母利用，從而可以更大程度地增加釀酒酵母的活性，使發(fā)酵進(jìn)行得更徹底[22]。2 種酵母（RF和VRC）對發(fā)酵酒還原糖含量影響不顯著。相對應(yīng)的，發(fā)酵時間和總酚含量受酵母種類影響比受氮源種類的影響大。RF酵母發(fā)酵速度快，14～15 d可以完成發(fā)酵（比重連續(xù)2 d不下降）；而使用VRC酵母時，接種后至發(fā)酵終止需22～24 d。VRC酵母發(fā)酵的酒樣中酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度為725～771 mg/L，顯著少于RF酵母發(fā)酵的酒樣（843～948 mg/L）。

2.3 不同條件發(fā)酵篤斯越橘果酒中香氣成分GC-MS分析

表2 篤斯越橘果酒中香氣物質(zhì)組成Table 2 Aroma composition of bog bilberry wine

續(xù)表2

4 種處理條件下發(fā)酵的篤斯越橘果酒香氣成分的鑒定結(jié)果見表2，GC-MS總離子流色譜圖見圖2。在所有酒樣中共鑒定出86 種香氣成分，酯類化合物最多，有32 種，其次為醇類18 種，萜烯類13 種，酸類10 種，醛酮類7 種，以及其他類6 種，檢測結(jié)果與文獻(xiàn)[13,23]報道一致。4 種酒樣含量最多的香氣成分均為異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯以及乙偶姻，質(zhì)量濃度分別為490～753、253～349、90～153 mg/L以及89～178 mg/L。酯類物質(zhì)閾值低，對果酒主體香氣貢獻(xiàn)最為顯著，對篤斯越橘果酒的香氣影響最大；醇類、酸類物質(zhì)閾值較高，對香氣成分影響有限。

圖2 各組篤斯越橘果酒香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig. 2 GC-MS chromatogram of bog bilberry wine

在RF酵母和DAP氮源發(fā)酵的酒中共鑒定出86 種香氣成分，其中大于閾值的有20 種；在RF酵母和NS氮源發(fā)酵的酒中共鑒定出80 種香氣成分，其中大于閾值的有18 種；在VRC酵母和DAP氮源發(fā)酵的酒中共鑒定出79 種香氣成分，其中大于閾值的有17 種；在VRC酵母和NS氮源發(fā)酵的酒中共鑒定出79 種香氣成分，其中大于閾值的有18 種。有研究表明，不同的酵母種類會在發(fā)酵過程中影響到高級醇及酯類的含量和比例，從而導(dǎo)致果酒最終出現(xiàn)香氣特征差異[24]。無機氮源含有的營養(yǎng)成分比有機氮單一很多，但有機氮源的使用并沒有使香氣增加，可能是由于無機氮源更容易被酵母利用。從發(fā)酵速率也可以看出（圖1），添加無機氮源的酒樣，發(fā)酵速率比添加有機氮源快。研究表明，添加有機氮源的酒樣，高級醇含量過高，從而會影響酒的品質(zhì)；本實驗中，只有VRC酵母發(fā)酵的酒樣，添加有機氮源產(chǎn)生的高級醇相對較多。此外，無機氮源被證實可使酒樣中丁酸乙酯含量升高，這與本實驗研究結(jié)果一致[25]。

2.4 不同條件下發(fā)酵篤斯越橘果酒的主要香氣成分比較

2.4.1 醇類組分的比較

醇類化合物是酒中主要的香氣物質(zhì)，總含量最高。4 種酒樣共檢測出醇類物質(zhì)18 種，共有14 種。其中含量最高的物質(zhì)為異戊醇和異丁醇，質(zhì)量濃度分別達(dá)到490～753 mg/L和253～349 mg/L，與前人研究一致，蓋禹含[15]和嚴(yán)紅光[16]等研究均表明3-甲基-1-丁醇（即異戊醇）是篤斯越橘果酒含量最高的香氣物質(zhì)，異戊醇具有青草和植物香氣。此外，檢測結(jié)果表明，1-丁醇、1-癸醇以及十二醇為RF酵母和DAP發(fā)酵的篤斯越橘果酒所特有，在其他3 種酒中均未檢出。

2.4.2 酯類組分的比較

發(fā)酵過程酒樣中的高級醇來源于氨基酸的降解，其濃度直接影響果酒香氣[19]。4 種酒共檢測出32 種酯類化合物，共有31 種，其中質(zhì)量濃度最高的物質(zhì)為乙酸乙酯，為90～153 mg/L，乙酸乙酯能賦予篤斯越橘果酒柔和的果香和奶油味[26]；其他對香氣有顯著貢獻(xiàn)的酯類化合物還有乙酸異戊酯、辛酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯等，這些化合物通常具有花香或果香味，如乙酸異戊酯具有強烈果香，似香蕉、梨的酸甜味[10]?？梢钥闯?，由于采用相同的原料發(fā)酵，不同酒中的酯類化合物種類和含量表現(xiàn)出了較高的相似性。

2.4.3 酸類組分的比較

酸類是篤斯越橘果酒中重要的協(xié)調(diào)成分，不僅影響酒的感官品質(zhì)，而且對花色苷等物質(zhì)具有保護(hù)作用[27]。4 種酒共檢測出酸類物質(zhì)10 種，香氣活性值大于1的香氣化合物共有4 種，分別是己酸、辛酸、癸酸以及9-癸烯酸，其中癸酸的含量僅在RF酵母發(fā)酵的2 種酒中超過了閾值，類似地，采用RF酵母發(fā)酵的酒中其他酸類物質(zhì)的含量大多也高于采用VRC酵母發(fā)酵的酒。

2.4.4 萜烯類和降異戊二烯類組分的比較

萜烯是酒中重要的呈香物質(zhì)，果酒中的萜烯主要來源于果實，隨著釀造和陳釀過程的進(jìn)行，果實中的糖苷結(jié)合態(tài)萜類會通過酶解或酸解作用形成游離態(tài)的萜類芳香成分，從而增強果酒的風(fēng)味[28]。4 種酒共檢測出萜烯類化合物13 種，有12 種為4 種酒所共有，蛇麻烯僅在RF酵母發(fā)酵的2 種酒中檢出。萜烯類物質(zhì)的含量雖然不高，但由于某些萜烯的閾值很低，所以對酒的香氣也有著十分重要的影響。在檢測到的萜烯化合物中香氣活性值最大的化合物是β-大馬士酮，它帶有玫瑰花香和異域香氣[13]，在所有萜烯類化合物中對香氣的貢獻(xiàn)最為顯著，其他萜烯類物質(zhì)的含量均未超過閾值。

2.4.5 醛酮類組分的比較

果酒發(fā)酵過程中，不飽和脂肪酸能夠在脂氧合酶的作用下，代謝產(chǎn)生醛和酮[29]。4 種酒中共檢測到7 種醛酮類化合物，含量均較少，大多以痕量存在，只有癸醛含量超過了閾值，另外，在RF酵母和NS氮源發(fā)酵的酒中檢測到少量蕓香酮，其他3 種酒樣中未檢出這2 種物質(zhì)。

2.4.6 其他組分的比較

在篤斯越橘果酒中還檢測到2-乙?；秽?、γ-丁內(nèi)酯、乙偶姻、傘花烴、3-甲硫基丙醇以及萘。除乙偶姻以外的其他化合物的含量均較少，在酒中痕量存在或含量遠(yuǎn)低于閾值；乙偶姻可產(chǎn)生令人愉快的奶油香氣[30]，在酒中質(zhì)量濃度達(dá)到89～178 mg/L，在RF酵母和DAP作為氮源發(fā)酵的酒與VRC酵母和NS氮源發(fā)酵的酒中乙偶姻的含量超過了閾值。

2.5 香氣輪廓圖

圖3 不同酵母和氮源發(fā)酵的篤斯越橘果酒香氣輪廓圖Fig. 3 Aroma profiles of bog bilberry wines fermented with different yeast species and nitrogen sources

食品中的香氣成分含量并不能完全反映其對整體香氣貢獻(xiàn)的大小，需結(jié)合香氣閾值考慮呈香組分的香氣活性值[31]。為了更好地體現(xiàn)香氣類型與組間差異，對各組分篤斯越橘果酒的香氣活性值取以10為底數(shù)的對數(shù)值，繪制香氣輪廓圖，如圖3所示。香氣活性值為香氣化合物的含量與感官閾值的比值，數(shù)值越大表示該香氣越突出。4 種處理生產(chǎn)的篤斯越橘果酒香氣輪廓較為相似：果香最濃，隨后是脂香和甜香，花香、化學(xué)味和青草香較弱。雖然能檢測到個別呈現(xiàn)堅果、焦糖和烘烤風(fēng)味的化合物，但均未達(dá)到閾值。4 種酒樣相比，RF＋DAP處理的酒樣香氣最為濃郁，果香、脂香和甜香的香氣活性值均遠(yuǎn)高于其他3 種處理的酒樣，這表明RF酵母產(chǎn)生香氣的能力明顯高于VRC，此外，與有機氮源（NS）相比，無機氮源（DAP）成分單一，質(zhì)量較穩(wěn)定，可被酵母快速利用，產(chǎn)生香氣成分的種類和含量增多[21]。

3 結(jié) 論

本實驗分析了不同酵母和氮源處理條件下發(fā)酵篤斯越橘果酒香氣成分的變化，采用RF酵母和DAP作為氮源的果酒發(fā)酵速度更快，發(fā)酵的殘?zhí)橇扛?，表現(xiàn)出了一定的發(fā)酵優(yōu)勢。香氣分析表明，盡管4 種處理條件下的果酒香氣化合物表現(xiàn)出一定的相似性，但仍存在種類和含量上的顯著區(qū)別，采用RF酵母和DAP氮源的酒樣香氣化合物種類最多，總量也高于其他處理果酒酒樣，該研究為提升篤斯越橘釀造果酒的品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

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