杜望春 盧新剛 王 堅(jiān)

(上海健康醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201318)

左旋多巴(LD)是目前治療帕金森病(PD)最有效的藥物，但在應(yīng)用LD治療的5～10年間，有70%～80%的患者會(huì)出現(xiàn)異動(dòng)癥(LID)，進(jìn)而加重PD患者病情，嚴(yán)重地影響了其生活質(zhì)量。如何科學(xué)合理地使用LD，通過聯(lián)合用藥協(xié)同發(fā)揮其最大的生物效應(yīng)，改善運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥，提高患者生活質(zhì)量是當(dāng)前面臨的重要課題〔1〕。LID機(jī)制復(fù)雜，可能主要與基底節(jié)的運(yùn)動(dòng)易化通路和運(yùn)動(dòng)抑制通路功能失衡有關(guān)〔2，3〕。盡管學(xué)術(shù)界對(duì)LID的臨床前和臨床研究進(jìn)入了深入研究，但現(xiàn)在仍沒有理想的藥物能預(yù)防和延緩LID的發(fā)生并應(yīng)用于臨床。

木犀草素(LT)是一種天然多酚黃酮類成分，多以糖苷的形式存在于多種植物(如全葉青蘭、野菊花、金銀花等)中，藥理研究顯示其具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等多種作用〔4～7〕。本研究以6-羥基多巴(6-OHDA)偏側(cè)PD大鼠為模型，考察LT對(duì)LID大鼠行為學(xué)的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，SPF級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(許可證號(hào)：SCXK滬2007-0005)。

1.2藥物和試劑 6-OHDA、阿撲嗎啡(APO)、LD均購于美國 Sigma公司；芐絲肼、LT(≥98%)購于阿拉丁公司。兔抗大鼠神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、兔抗大鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；GADPH單克隆抗體購于碧云天生物技術(shù)研究所。腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自博士德生物科技有限公司。

1.3儀器 Elx800酶標(biāo)儀(BioTek)，ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-RAD)。

1.4方法

1.4.16-OHDA偏側(cè)PD大鼠模型的建立和行為學(xué)評(píng)價(jià) 大鼠經(jīng)12 h 以上禁食(不禁水)后稱重，40 g/L水合氯醛(0.3 ml/100 g，灌胃)麻醉，按楊曉帆等〔8〕方法建模：將其以嚴(yán)格平顱位固定于大鼠腦立體定向儀上，常規(guī)消毒后，剪開頭皮，剝離骨膜，用3%H2O2止血并充分暴露前囟。向右側(cè)紋狀體注射4 μg/μl的6-OHDA 4 μl，注射過程中分4點(diǎn)，并嚴(yán)格依據(jù)下列坐標(biāo)：前囟前、中線旁開、顱骨下分別為1.2 mm和1.2 mm，2.5 mm和3.5 mm，4.5、6.5 mm和 4.5、6.5 mm。每點(diǎn)的注射速度和注射量均分別為1 μl/min和1 μl。完成注射留針5 min后以較慢的速度退出。常規(guī)消毒并縫合傷口，待大鼠清醒后送回動(dòng)物房飼養(yǎng)。假手術(shù)組在相同位點(diǎn)注射含0.2%維生素(Vit)C的注射生理鹽水，其余操作均與模型組相同。術(shù)后每天觀察大鼠的自主行為變化：有無頭偏斜、震顫、活動(dòng)遲緩、少動(dòng)、尾僵直、豎毛、抓握、嗅探等異常行為；2 w后腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘導(dǎo)其對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，10 min后記錄30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，>平均7 轉(zhuǎn)/min(總計(jì)≥210圈)的大鼠視為成功的PD大鼠。

1.4.2分組與給藥 選擇造模成功的PD大鼠，于APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為2 d 后，隨機(jī)分為LT組(10和30 mg/kg)、LID組和空白基質(zhì)組，每組12只。首先分別每天1次腹腔注射LT空白基質(zhì)、10和30 mg/kg LT，30 min后腹腔注射LD(10 mg/kg)和外周脫羧酶抑制劑芐絲肼(2.5 mg/kg)；空白基質(zhì)組腹腔注射芐絲肼(2.5 mg/kg)，連續(xù)用藥21 d。

1.4.3異常不自主運(yùn)動(dòng)評(píng)分(AIM) 參照Lee等〔9〕LID模型大鼠AIM評(píng)分表，分別于腹腔注射LD/芐絲肼后第1、5、9、13、17、21天進(jìn)行評(píng)分，評(píng)定給藥后120 min內(nèi)AIM分?jǐn)?shù)。每20 min評(píng)定1次，每次1 min，共6次。將AIM分為4個(gè)部分進(jìn)行評(píng)定：①軸性AIM：頭部及軀體朝向損毀側(cè)的側(cè)屈及軸性旋轉(zhuǎn)；②上肢AIM：頭部及軀體朝向損毀側(cè)的側(cè)屈及軸性旋轉(zhuǎn)；③口面部AIM：重復(fù)性的吐舌及下頜咀嚼行為；④運(yùn)動(dòng)AIM：損毀對(duì)側(cè)前肢重、節(jié)律性的反射運(yùn)動(dòng)或肌肉運(yùn)動(dòng)障礙。每部分又根據(jù)其有無和嚴(yán)重程度分5個(gè)等級(jí)(0～4)：0：無；1：偶爾出現(xiàn)；2：經(jīng)常出現(xiàn)；3：持續(xù)存在，刺激使之停止；4：持續(xù)存在，刺激不使之停止。

1.4.4ELISA 法檢測(cè)大鼠腦紋狀體中TNF-α和IL-1β的含量 大鼠斷頭取腦后，在冰上分離出紋狀體。按100 g/L的稀釋比例，用組織勻漿器勻漿，將勻漿液在4℃，10 000 r/min的條件下離心20 min，收集上清。按照大鼠ELISA試劑盒操作說明測(cè)定腦紋狀體勻漿液中炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量。

1.4.5Western印跡蛋白免疫印跡 大鼠斷頭取腦，迅速冰上剝離出紋狀體，加入適量組織裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，超聲裂解，提取總蛋白。用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定白蛋白濃度后加入5倍十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，入沸水煮5 min，冰上冷卻，置-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?0 μg蛋白樣本進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，4℃過夜孵育一抗，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，置于暗室曝光顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件。組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LT對(duì)LD誘導(dǎo)LID大鼠行為學(xué)的影響 接受慢性LD治療的6-OHDA偏側(cè)PD大鼠出現(xiàn)不自主運(yùn)動(dòng)，主要表現(xiàn)為軀干、肢體、頭面部及行走等的異常運(yùn)動(dòng)。經(jīng)LD治療后，PD大鼠多在第2～3天出現(xiàn)癥狀，隨治療時(shí)間延長評(píng)分逐漸升高，2 w左右基本達(dá)到高峰。合用LT治療后，能顯著降低 LD 引起的軸性、上肢、口面部和運(yùn)動(dòng)的AIM值(P<0.05)，其中對(duì)上肢AIM值的影響最弱，見圖1。LT 10、30 mg/kg治療組間行為學(xué)特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2LT對(duì)LID大鼠紋狀體勻漿中TNF-α和IL-1β水平的影響 LID組紋狀體中TNF-α和IL-1β表達(dá)較空白基質(zhì)組顯著增高(P<0.05)。LT 10、30 mg/kg組的大鼠紋狀體勻漿中TNF-α和IL-1β水平較LID組和空白基質(zhì)組顯著下降(P<0.05)，且與LT10 mg/kg組相比，30 mg/kg組更能顯著地降低TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)。見表1。

2.3Western印跡檢測(cè)GFAP和iNOS蛋白的表達(dá)水平 LID組GFAP和iNOS蛋白表達(dá)與空白基質(zhì)組相比有明顯升高(P<0.05)。LT 10和30 mg/kg組大鼠紋狀體中GFAP和iNOS蛋白表達(dá)與 LID組和空白基質(zhì)組相比有顯著下降(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖2。

與LID組相比：1)P<0.05圖1 LT對(duì)LID模型大鼠AIM值的影響

表1 LT對(duì)紋狀體組織勻漿中 TNF-α和IL-1β水平的影響

與LID組相比：1)P<0.05；與空白基質(zhì)組相比：2)P<0.05；與LT 10 mg/kg組相比：3)P<0.05

圖2 LT對(duì)LID模型大鼠紋狀體中GFAP和iNOS表達(dá)的影響

3 討 論

神經(jīng)免疫炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在多巴胺能神經(jīng)元變性甚至死亡中發(fā)揮著重要作用。體外細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星狀細(xì)胞通過產(chǎn)生氧自由基、活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、前列腺素(PG)E或細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等引起腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加劇小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，分泌的炎性物質(zhì)在腦內(nèi)積聚導(dǎo)致神經(jīng)毒性，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡〔1～3〕。對(duì)PD患者進(jìn)行病理解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)，在中腦變性的黑質(zhì)細(xì)胞周圍有大量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，而且激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目與腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元變性的范圍密切相關(guān)〔10〕。

體內(nèi)外研究表明金剛烷胺(ATD)能抑制激活的核因子(NF)-κB信號(hào)通路，減少炎性細(xì)胞因子如TNF-α等釋放和表達(dá)，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化〔11〕。Barnum等〔12〕給予6-OHDA損傷大鼠腹腔內(nèi)注射內(nèi)源性抗炎藥皮質(zhì)酮和紋狀體內(nèi)注射IL-1受體阻斷劑，能降低模型大鼠LID引起的AIM值，表明神經(jīng)炎癥可能參與LID的發(fā)病機(jī)制。Bortolanza等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)LID模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和OX-12的表達(dá)有顯著性增加，選擇性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑7-硝基吲唑(7-NI)30 mg·kg-1·d-1能改善LID大鼠的行為學(xué)特征，并能顯著抑制GFAP和OX-12的表達(dá)，表明抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、減少炎性因子的釋放能改善LID的進(jìn)展。

LT是一種天然四羥基黃酮化合物，能顯著抑制LPS誘導(dǎo)大鼠腦原代混合細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α、NO和超氧自由基，顯著增加原代混合細(xì)胞對(duì)多巴胺的攝取，起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用〔14〕。Zhu等〔5〕證實(shí)LT能顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的NF-κB、MAPK和Akt等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制炎性因子的釋放，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)的作用。這顯示LT能抑制中樞神經(jīng)炎性反應(yīng)，因此在治療神經(jīng)炎性相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有廣闊的應(yīng)用前景。本研究表明LT能顯著改善PD模型大鼠的LID癥狀，減弱LID發(fā)生。機(jī)制研究結(jié)果顯示，LT能顯著抑制PD模型大鼠在接受LD治療后誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低TNF-α和IL-1β等炎性因子的釋放，改善其行為學(xué)表現(xiàn)特征，從而發(fā)揮治療LID的作用，但其明確的機(jī)制及與其他作用機(jī)制的相互關(guān)系有待進(jìn)一步明確。

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