高 藝 陳清光 阿布都卡地爾·阿不都拉 裴曉黎

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200000)

載脂蛋白(Apo)CⅢ是脂蛋白代謝中主要調(diào)節(jié)蛋白之一，可提高心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在T-455、SSTI等突變基因人群中ApoCⅢ高表達(dá)，血漿三酰甘油(TG)水平增加，心血管疾病發(fā)生風(fēng)險明顯提升；而在R19x突變基因人群中ApoCⅢ低表達(dá)，血漿TG水平降低且高密度脂蛋白含量增加，冠心病發(fā)生風(fēng)險降低〔1〕。ApoCⅢ作為一個獨立的促動脈粥樣硬化因子，過量表達(dá)可以導(dǎo)致高脂血癥并且促進(jìn)動脈粥樣硬化的病變發(fā)展〔2〕。本研究探討ApoCⅢ對動脈粥樣硬化的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 ApoCⅢ轉(zhuǎn)基因小鼠與LDLR小鼠雜交得到雙基因修飾小鼠。取10周齡雄性雙基因修飾小鼠12只為實驗組，LDLR小鼠12只為對照組，兩組均先普通飼料喂養(yǎng)1個月后用高脂飼料常規(guī)喂養(yǎng)3個月，斷髓處死后左心室注入固定液，取心臟和完整主動脈。主要試劑：8-前列腺素檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、還原性谷胱甘肽檢測試劑盒均購于南京信帆生物技術(shù)有限公司；活性氧(ROS)熒光探針-二氫乙啶購于威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；鼠源單克隆抗體還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NOX)-4、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78單克隆抗體購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司；二抗購于上海恒斐生物科技有限公司。

1.2主動脈和流出道形態(tài)學(xué)檢測 顯微鏡視野下縱向剖開主動脈，觀察粥樣硬化斑塊沉積并進(jìn)行油紅O染色，掃描染色呈陽性的區(qū)域并進(jìn)行形態(tài)學(xué)定量，計算陽性面積；制備主動脈流出道，油紅O染色后計算粥樣硬化斑塊面積；選用平滑肌細(xì)胞特異性抗體SM22a染色和巨噬細(xì)胞特異性抗體MAC3染色觀察硬化斑塊分布情況。使用Leica Microsystems軟件對斑塊面積進(jìn)行定量分析，用硬化斑塊面積與主動脈全長的面積的比值進(jìn)行表示。

1.3血漿脂質(zhì)和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 兩組小鼠分別于普通飼料喂養(yǎng)1個月及高脂喂養(yǎng)3個月時，禁食6 h，肝素抗凝尾部采血，4℃恒溫5 000 r/min 離心10 min，分離血漿。酶法檢測總膽固醇(TC)和TG水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿脂質(zhì)過氧化物8-異前列腺素水平；比色法檢測MDA水平；酶法檢測還原性谷胱甘肽水平。

1.4主動脈ROS檢測 小鼠主動脈壁行ROS熒光探針-二氫乙啶染色，檢測ROS含量水平。二氫乙啶可自由透過活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，被細(xì)胞中的ROS氧化后生產(chǎn)二氫乙啶，滲入主動脈壁染色體中顯示紅色熒光。根據(jù)熒光數(shù)量可判斷ROS含量和變化。

1.5主動脈基因表達(dá)情況檢測 高脂喂養(yǎng)3個月后，使用蛋白和mRNA提取試劑盒，分別提取兩組小鼠主動脈總RNA和蛋白。RT-PCR檢測參與氧化應(yīng)激基因mRNA表達(dá)情況，包括：纖溶酶原激活物抑制物(PAI)-1、NOX、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、p67；參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因mRNA表達(dá)情況，包括：GRP78、X盒結(jié)合蛋白(XBP)-1、增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)。Western印跡檢測氧化應(yīng)激蛋白NOX-4和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78的表達(dá)情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿中脂質(zhì)水平比較 普通飼料喂養(yǎng)時實驗組小鼠血漿TG(8.35±2.40)mmol/L，明顯高于對照組〔(2.58±0.69)mmol/L，P<0.01〕；TC〔(10.91±2.23)mmol/L〕明顯高于對照組〔(6.82±0.95)mmol/L，P<0.05〕。高脂喂養(yǎng)3個月后，實驗組小鼠TG〔(6.63±2.47)mmol/L〕顯著高于對照組〔(1.83±0.76)mmol/L，P<0.01〕。實驗組和對照組TC〔(23.57±0.48)mmol/L〕、〔(21.66±2.20)mmol/L〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組動脈粥樣硬化情況比較 高脂喂養(yǎng)3個月后，兩組主動脈全長染色均顯示出動脈粥樣硬化斑塊，其中實驗組主動脈流出道處硬化斑塊更為明顯(見圖1)。實驗組粥樣硬化斑塊面積〔(18.39±3.51)×104μm2〕明顯大于對照組〔(9.61±1.95)×104μm2，P<0.05〕。實驗組平滑肌細(xì)胞〔(11.26±2.85)×104μm2〕和巨噬細(xì)胞中硬化斑塊面積〔(15.34±1.96)×104μm2〕均明顯大于對照組〔(5.90±1.13)×104μm2、(8.65±2.07)×104μm2，P<0.05〕。見圖2。

圖2 兩組流出道動脈粥樣硬化病變情況(×40)

2.3兩組氧化應(yīng)激和主動脈ROS水平 實驗組與對照組小鼠血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物8-異前列腺素水平分別為(246.82±21.07)ng/L、(113.92±13.38)ng/L；MDA水平分別為(138.20±10.71)mol/L、(53.14±4.36)mol/L；還原性谷胱甘肽水平分別為(53.14±4.36)μmol/L、(138.20±10.71)μmol/L。實驗組與對照組主動脈壁ROS水平分別為〔(19.07±3.65)×104μm2〕、〔(9.25±1.36)×104μm2〕，見圖3。實驗組8-前列腺素、MDA、ROS水平明顯高于對照組，還原性谷胱甘肽水平明顯低于對照組(P<0.05)。

2.4兩組主動脈與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因變化情況 實驗組氧化應(yīng)激相關(guān)基因PAI-1、NOX、eNOS、SOD、p67 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78、XBP-1、CHOP相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。實驗組與對照組氧化應(yīng)激相關(guān)基因NOX-4蛋白的相對表達(dá)量分別為(56.39±3.75)、(28.61±1.68)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78蛋白的相對表達(dá)量分別為(94.62±16.18)、(42.95±11.35)；實驗組NOX-4、GRP78蛋白表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 兩組主動脈二氫乙啶染色情況(×40)

表1 兩組主動脈與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

與對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

ApoCⅢ被認(rèn)為血脂異常、內(nèi)皮功能障礙、炎癥和心血管疾病的共同關(guān)聯(lián)分子，可作為預(yù)測冠心病的危險因素〔3〕。本研究結(jié)果證實，ApoCⅢ高表達(dá)可獨立于血漿TC水平之外，對動脈粥樣硬化過程起明顯促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)高氧化應(yīng)激水平時，炎癥因子和血漿ApoCⅢ也處于高水平〔4〕。8-異前列腺素水平主要由自由基誘發(fā)不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)后分泌的小分子脂類物質(zhì)，為前列腺異構(gòu)體。MDA是體內(nèi)活性氧與多不飽和脂肪酸產(chǎn)生氧化反應(yīng)生成的終產(chǎn)物。還原性谷胱甘肽是由3個氨基酸共同構(gòu)成的小分子肽，在體內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化和清除自由基作用，將體內(nèi)有害物質(zhì)轉(zhuǎn)出體外。Guettier等〔5〕認(rèn)為，ApoCⅢ多態(tài)性位點能和脂肪酸結(jié)合蛋白2相互作用，從而導(dǎo)致代謝綜合征的發(fā)生率增加。最新研究顯示，代謝綜合征患者機體中極低密度脂蛋白(VLDL)分泌量增加，血漿ApoCⅢ水平提升，用該類患者血漿分離出的VLDL可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成，誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔6〕。NOX介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可影響內(nèi)皮祖細(xì)胞正常功能，在多種心血管疾病發(fā)展中起重要作用。本研究提示ApoCⅢ高表達(dá)可激活NOX、PAI-1、eNOS、SOD、 p67表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣氧化斑塊的形成。相關(guān)研究顯示，氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在相關(guān)性〔7〕；一項對小鼠胰島細(xì)胞研究顯示，ApoCⅢ可提升高胰島β細(xì)胞中鈣離子水平并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞中鈣離子濃度增加與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也存在相關(guān)性〔8〕。本研究提示ApoCⅢ高表達(dá)可激活GRP78、XBP-1、CHOP表達(dá)水平，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，誘發(fā)動脈粥樣氧化斑塊的形成。

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