劉玉含 閆 琛 康運(yùn)凱 魏 攀

(鄭州人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450003)

食管癌死亡率較高，多數(shù)患者在中晚期才被確診，具有較高的轉(zhuǎn)移率，預(yù)后差〔1〕。同源異型盒(HOX)B7屬于HOX基因家族B簇成員之一，它在人類DNA的合成、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用，HOXB7異常表達(dá)可能導(dǎo)致肝癌、肺腺癌、結(jié)腸癌發(fā)生〔2～4〕。本研究探討HOXB7與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。

1 材料和方法

1.1材料收集 25例食管鱗癌及癌旁正常食管上皮組織取自鄭州人民醫(yī)院手術(shù)患者，病理結(jié)果證實為食管鱗癌，其中男15例，女10例，年齡<60歲為8例，≥60歲為17例。標(biāo)本收集后立即置于液氮保存，用于提取總RNA。食管鱗癌石蠟組織標(biāo)本56例來自鄭州人民醫(yī)院病理科，其中男33例，女23例，年齡<60歲為14例，≥60歲為42例。全部樣品分別在食管鱗癌癌灶組織和距離腫瘤至少5 cm以外的正常食管黏膜組織處取材，所有組織標(biāo)本立即用乙醇固定，后脫水、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，行組織病理學(xué)診斷和免疫組化染色。病例術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。

1.2主要試劑 Trizol RNA 試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自日本TAKARA公司，特異性引物購自北京奧科生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，小鼠抗人HOXB7單克隆抗體和辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司，免疫組化S-P試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3RT-PCR法檢測食管鱗癌組織和癌旁正常食管組織中HOXB7 mRNA的表達(dá)水平 按Trizol試劑說明書的方法提取總RNA，用紫外分光光度儀分析純度和濃度，后取部分總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。收集的總RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的去離子水中，-80℃保存。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，實驗條件：42℃ 10 min，95℃2 min。采用Primer5.0軟件設(shè)計HOXB7引物(引物序列見表1)，β-actin作為內(nèi)參?；驍U(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 5 min(1個循環(huán))；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s(30個循環(huán))；72℃ 10 min(1個循環(huán))。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物在含EB的1.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析以β-actin為內(nèi)參，計算HOXB7的mRNA相對表達(dá)量。HOXB7上游引物5′-TACCCCTGGATGCGAAGCTC-3′，下游引物5′-AATCTGATCTGTCTTCGTGA-3′，大小627 bp。β-actin上游引物5′-CGCCGCGCTCGTCGTCGACA-3′，下游引物5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，大小216 bp。

1.4免疫組織化學(xué)SP法檢測食管鱗癌組織和癌旁正常食管上皮組織石蠟切片中HOXB7蛋白的表達(dá)水平 用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mmol/L，pH=7.4)替代一抗作為陰性對照。以英國Abcam公司提供的陽性切片作為陽性對照。HOXB7主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒判讀為陽性細(xì)胞。評分標(biāo)準(zhǔn)：觀察并記錄組織切片中的兩項指標(biāo)，染色陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率和陽性細(xì)胞著色程度，綜合評估試驗結(jié)果。組織切片中陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比可分為4級：陽性細(xì)胞<10%，0分，10%～25%，1分，26%～50%，2分，>50%，3分。組織切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度分為3級：未著色，0分，淡黃色，1分，棕褐色2分。2項指標(biāo)的結(jié)果相乘得到0分為(-)，≥1分為(+)。染色結(jié)果及評分由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生獨立操作進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗或方差檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌和癌旁正常食管組織中HOXB7 mRNA的表達(dá) HOXB7 mRNA在食管鱗癌中明顯高表達(dá)，而在正常食管上皮中表達(dá)較低(圖1)。25例食管鱗癌標(biāo)本中HOXB7 mRNA相對表達(dá)量為(0.612±0.094)，而癌旁正常食管組織中HOXB7 mRNA表達(dá)量為(0.108±0.035)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2食管鱗癌和癌旁正常食管組織中HOXB7蛋白的表達(dá) 食管鱗癌組織中HOXB7蛋白表達(dá)率〔62.50%(35/56)〕明顯高于正常食管上皮〔16.07%(9/56)；P<0.05〕。

2.3HOXB7蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理資料之間的關(guān)系 HOXB7蛋白的表達(dá)水平與食管鱗癌的組織分化程度、TNM分期、浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，不同性別和年齡患者HOXB7表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

M：Marker;1,2:正常食管組織；3，4：食管癌組織圖1 食管鱗癌及癌旁正常組織中HOXB7 mRNA及β-actin 的電泳條帶

表1 食管癌患者不同臨床病理HOXB7蛋白陽性表達(dá)差異

3 討 論

HOXB7基因定位于人染色體17q21.3〔4〕，HOXB7基因所編碼的蛋白均為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)信號分子、血管內(nèi)皮生長因子、黏附因子及堿性成纖維細(xì)胞生長因子等相互結(jié)合發(fā)揮作用，從而抑制或者激活相應(yīng)下游靶基因序列，參與多種生物學(xué)活動〔5〕。文獻(xiàn)證明HOXB7在胰腺癌〔6〕、胃癌〔7〕和惡性黑色素瘤〔8〕等多種惡性腫瘤中均有過度表達(dá)。趙宇清等〔9〕通過下調(diào)HOXB7基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞G1期發(fā)生阻滯，細(xì)胞凋亡增多，同時細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和CyclinE表達(dá)下降，因此認(rèn)為，HOXB7可直接影響細(xì)胞周期調(diào)控。本研究結(jié)果說明HOXB7在食管鱗癌中起原癌基因的作用，HOXB7可能是參與食管鱗癌進(jìn)展的有價值的新的腫瘤標(biāo)志物。本文結(jié)果與原薇薇等〔3〕在肺腺癌組織中研究結(jié)果大致相同，提示HOXB7過表達(dá)與食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1李秀娟，金春亭，范 婕，等.Oct4和Wnt1在食管鱗癌中的表達(dá)及其相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(10)：2631-2.

2張念杰，張剛慶，高 鵬，等.同源盒基因B7在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2013；29(11)：1776-9.

3原薇薇，譚 艷，杜 敏，等.HOXB7基因在肺腺癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志，2014；19(11)：987-91.

4王冬清，嚴(yán)東旺，唐華美，等.同源異形盒基因HOXB7在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(3)：438-40.

5Cantile M，F(xiàn)ranco R，Schiavo G，etal.The HOX genes network in uro-genital cancers：mechanisms and potential therapeutic implications〔J〕.Curr Med Chem，2011；18(32)：4872-84.

6郭 貞，江衛(wèi)華，金子良，等.下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HOXB7抑制胰腺癌BXPC3細(xì)胞侵襲及遷移機(jī)制研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015；23(10)：1344-8.

7周崇治，韓 楊，凃威偉，等.同源盒基因家族在胃癌中差異表達(dá)的研究〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(7)：1507-10.

8彭思達(dá)，葛林虎，王春燕，等.siRNA對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中HOXB7基因的干涉作用研究〔J〕.中國腫瘤臨床，2007；34(6)：312-5.

9趙宇清，黃 妍，高蜀君，等.下調(diào)HOXB7基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討〔J〕.中國癌癥雜志，2013；23(3)：173-8.