宋云林，譚秋嬋，馬燕，白林林，柴瑞峰，王毅，于湘友

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是干細(xì)胞移植治療缺血性疾病的重要種子細(xì)胞，目前基礎(chǔ)研究已有一定進(jìn)展，但長期療效值得商榷，其中EPC復(fù)制性衰老可能是影響其長期療效的重要因素。p53可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯引起衰老或凋亡；沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）參與了多種重要的抗衰老基因的調(diào)控，能使p53蛋白活性下降；微小核糖核酸（miR）-34a能抑制SIRT1及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等的基因表達(dá)，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老；故推測p53-miR-34a-SIRT1反饋環(huán)在細(xì)胞衰老過程中起著重要作用[1]。同時，活化后的p53也能增加miR-34a的表達(dá)，進(jìn)一步強化對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。另一方面，miR-34a通過抑制SIRT1的產(chǎn)生，從而促進(jìn)p53的活化[2,3]。故由此推測p53-miR-34a-SIRT1形成的正反饋環(huán)在細(xì)胞凋亡和增殖的過程中扮演者重要的角色。本研究的目的為明確p53-miR-34a-SIRT1在EPC復(fù)制性衰老過程中的反饋調(diào)節(jié)機制，評估m(xù)iR-34a抑制因子能否成為延緩EPC衰老的靶點，為提高EPC治療缺血性疾病的療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

材料：20份臍血，每份50 ml（來源于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，均簽署知情同意書并獲醫(yī)院科研倫理委員會同意）。

試劑及儀器：EGM-2培養(yǎng)基（Lonza公司，瑞士）；人淋巴細(xì)胞分離液（LymphoprepTM，Axisshield 公司，挪威）；胰蛋白酶（Tryptase，Sigma 公司，美國）；小鼠抗人CD34單克隆抗體（BD公司，美國）；小鼠抗人CD133單克隆抗體 （Miltenyi公司，德國）； 小鼠抗人p53單克隆抗體、小鼠抗人乙?；痯53（Ac-p53）單克隆抗體和兔抗人SIRT1多克隆抗體（CST公司，美國）；細(xì)胞周期檢測試劑盒和AnnexinV/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物有限公司，中國）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，中國）；超凈工作臺（SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)安泰空氣公司，中國）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Formo公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；光學(xué)顯微鏡（OlymPus公司，日本）；流式細(xì)胞儀（DB公司，美國）。

EPC分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定方法：在胎盤、臍帶與母體和胎兒完全分離以后，無菌條件下取臍血約50 ml。臍血中加入肝素（20 U/ml）抗凝，以1 000 rpm離心10 min，吸除上清液，以10 ml含10%小牛血清的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋細(xì)胞，加入人淋巴細(xì)胞分離液15 ml，以2 000 rpm離心15 min，輕輕旋轉(zhuǎn)吸取呈乳白色的第2層單核細(xì)胞（MNC）層，加入EGM-2培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為 1×105/cm2，置于12.5 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞擴(kuò)增情況，待細(xì)胞長滿到細(xì)胞瓶80%左右傳代。采用免疫熒光技術(shù)對第二代細(xì)胞進(jìn)行EPC細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD34鑒定。觀察第三代和第六代細(xì)胞在衰老、凋亡、周期和血管形成等方面的差異，檢測第三代和第六代細(xì)胞p53、乙?；膒53（Ac-p53）、SIRT1的表達(dá)情況。構(gòu)建攜帶干擾SIRT1的miR-34a抑制因子的慢病毒載體（由復(fù)能基因有限公司構(gòu)建合成），以第六代EPC作為實驗對象，以空載慢病毒轉(zhuǎn)染EPC作為對照組，miR-34a抑制因子慢病毒載體轉(zhuǎn)染EPC作為轉(zhuǎn)染組，檢測兩組細(xì)胞p53和SIRT1的表達(dá)差異，觀察兩組細(xì)胞在衰老、凋亡和血管形成等方面的差異，明確外源性miR-34a抑制因子能否延緩EPC的凋亡。

流式細(xì)胞儀測定EPC凋亡率：采用AnnexinVFITC/PI雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測EPC的凋亡率。0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，2 000 rpm離心5 min，棄上清，收集5×105個細(xì)胞，加0.5 ml結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻后在加入5 μl PI，混勻并室溫避光反應(yīng)10～20 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果分析：左下象限為陰性正常細(xì)胞（Annexin V-/PI-）；右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI+）；右下象限為早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）。

流式細(xì)胞儀分析EPC細(xì)胞周期：收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌1次，2 000 rpm離心5 min，重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106/ml，取1 ml細(xì)胞懸液2 000 rpm離心5 min，棄上清，加入500 μl 70%冷乙醇固定，4℃過夜；離心后棄乙醇，PBS洗滌1次后加入100 μl 5'核酸內(nèi)切酶，37℃孵育30 min，再加入500 μl PI染色，4℃避光反應(yīng)30 min；流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，分析數(shù)據(jù)。

β-半乳糖苷酶染色標(biāo)記EPC衰老細(xì)胞：β-半乳糖苷酶染色試劑以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）為底物，只有衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍(lán)色產(chǎn)物。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后以5×103/孔的細(xì)胞密度種植在12孔板中；次日吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入500 μl β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min；PBS洗3次，每次3 min；每孔加入500 μl染色工作液；37℃恒溫水浴箱中孵育過夜；普通光學(xué)顯微鏡下觀察、計數(shù)藍(lán)染的細(xì)胞。

EPC血管形成實驗：將保存于-20℃的基質(zhì)膠拿出4℃過夜解凍；12孔板和槍頭都提前放在-20℃冰箱降溫30 min；把基質(zhì)膠加入12孔板之后4℃放置20 min，再室溫放置30 min，后放入37℃孵箱30 min；每孔種植EPC 1.5×105個，于6 h光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞血管形成情況。

蛋白質(zhì)印跡法檢測EPC中p53、Ac-p53、SIRT1蛋白的表達(dá)：PBS洗待測細(xì)胞2 次，每孔加入 120 μl裂解液，含 1.2 μl苯甲基磺酰氟（PMSF）；細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于1.5 ml離心管中，冰上放置30 min，讓細(xì)胞充分裂解；12 000 g（4℃）離心15 min收集上清至EP管中冰上放置；使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。5×上樣緩沖液加入到已調(diào)整好濃度的蛋白樣品中，煮沸5 min使蛋白變性，-20℃保存?zhèn)溆?。配?0%蛋白電泳分離膠和5%濃縮膠，取30 μg蛋白上樣，電泳80 V/180 min，半干法轉(zhuǎn)膜15 V/20 min；5%脫脂奶粉/TBS-T（加了Tween的三乙醇胺緩沖鹽水溶液）封閉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜1 h；一抗稀釋液配置一抗p53、Ac-p53和 SIRT1（1:1 000）孵育 PVDF膜 4℃過夜，TBS-T 洗滌5次；TBS-T 稀釋相應(yīng)的二抗（1:6 000），室溫孵育 PVDF膜 1 h；TBS-T 洗滌 5次。凝膠成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，Imag-J測量光密度值，以目的蛋白和β-肌動蛋白帶的密度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

攜帶miR-34a 抑制因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞以1×105/孔種植到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2×105/孔左右。次日用含6 μg/ml聚凝胺的2 ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入16 μl慢病毒懸液（最適感染復(fù)數(shù)MIO值≈15.3；miR-34a 抑制因子慢病毒滴度=1.9×108TU/ml）。37℃孵育，4 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋聚凝胺。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行相關(guān)實驗。

統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用t檢驗方法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

培養(yǎng)3 d后，EPC開始貼壁生長，細(xì)胞多呈長梭形。7 d左右，出現(xiàn)由多角形和梭形細(xì)胞組成的小集落，隨后細(xì)胞迅速生長。約10～14 d可出現(xiàn)大面積集落，呈典型鋪路石樣，即為EPC 細(xì)胞集落。取第二代EPC進(jìn)行鑒定，免疫熒光技術(shù)檢測CD34、CD133均呈陽性反應(yīng)，符合EPC表型特點。

2.2 第三代與第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞顯微鏡下狀態(tài)、衰老和血管形成能力方面的差異（圖1）：

EPC在傳代的過程中發(fā)生了復(fù)制性衰老。與第三代EPC相比，顯微鏡下第六代EPC凋亡脫落的細(xì)胞較多；β-半乳糖苷酶染色顯示，第六代EPC衰老細(xì)胞明顯增多 [（7.0±2.8）% vs（31.2±5.4）%，P＜0.05]；第六代EPC的血管形成能力也明顯減弱（P＜0.05）。

圖1 第三代與第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞顯微鏡下狀態(tài)、衰老及血管形成能力比較（×10，n=3）

2.3 第三代與第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中p53、Ac-p53和SIRT1蛋白的表達(dá)差異（圖2）

第六代EPC中p53表達(dá)量高于第三代EPC，相反Ac-p53表達(dá)量則比第三代EPC少，SIRT1的表達(dá)量也低于第三代EPC（P均＜0.05）。

2.4 第三代與第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞各細(xì)胞周期的情況和細(xì)胞凋亡率比較（表1）

與第三代EPC相比，第六代EPC大部分阻滯于G0/G1期，S 期及G2/M期減少。AnnexinV-FITC/PI雙染色結(jié)果顯示，第六代EPC晚期凋亡率高于第三代EPC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 第三代和第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中p53、Ac-p53和SIRT1蛋白的表達(dá)差異（n=3）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測第三代和第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞各細(xì)胞周期比例和凋亡率（%，±s，n=3）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測第三代和第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞各細(xì)胞周期比例和凋亡率（%，±s，n=3）

注：EPC：內(nèi)皮祖細(xì)胞。與第三代同期EPC比較**P＜0. 01 *P＜0. 05

第三代 74.30±1.01 2.57±1.05 18.13±4.46 2.1±0.64.2±1.2

2.5 轉(zhuǎn)染miR-34a抑制因子慢病毒載體后的第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中SIRT1和p53蛋白的改變（圖3）

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的SIRT1蛋白表達(dá)較對照組明顯增多[（1.35±0.04） vs（1.00±0.03），P＜0.05]，p53蛋白表達(dá)則明顯減少[（0.65±0.08） vs （1.00±0.07），P＜0.01 ]。

圖3 第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對照組和轉(zhuǎn)染組中SIRT1 和p53蛋白表達(dá)情況（n=3）

2.6 轉(zhuǎn)染miR-34a抑制因子慢病毒質(zhì)粒的第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老、血管形成能力及凋亡情況（圖4）

與對照組相比，轉(zhuǎn)染組衰老情況有所改善，血管形成能力也增強，晚期凋亡率明顯減少[（9.46±3.61）% vs（3.72±3.64）%，P＜0.01]。

圖4 第六代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞衰老、血管形成能力及細(xì)胞凋亡情況（×10，n=3）

3 討論

EPC作為具有增殖潛能的血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，不僅參與生理性血管形成，在多種病理狀態(tài)下也能被動員出骨髓并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)形成新生血管，緩解組織缺血和修復(fù)血管損傷[4]。研究表明，血循環(huán)中的EPC可來源于多種組織，如骨髓、髓外的脂肪組織、脾臟、肌肉、動脈外膜等，臍帶血及臍帶組織也是EPC體外研究重要的來源之一。另外，循環(huán)中的多能干細(xì)胞也可以在細(xì)胞因子刺激下分化為EPC。EPC能顯著改善肢體缺血[5]。Kalka等[6]報道，接受人EPC治療的小鼠下肢血流量明顯增加，缺血肢體成活率顯著提高。作為干細(xì)胞的一種，EPC治療缺血性疾病在動物模型中的短期療效已有諸多報道，但其長期治療效果和安全性少有報道，在臨床中也未得到廣泛應(yīng)用。

細(xì)胞復(fù)制性衰老是指細(xì)胞經(jīng)過一定次數(shù)的分裂后進(jìn)入不可逆的細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)。正常體細(xì)胞在體外經(jīng)歷一段時間的培養(yǎng)后，細(xì)胞會停止增殖進(jìn)入衰老狀態(tài)，無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)，惡性腫瘤細(xì)胞則不進(jìn)入衰老狀態(tài)而能保持持續(xù)的增殖狀態(tài)。衰老和腫瘤的關(guān)系非常密切，隨著年齡的增加，衰老細(xì)胞數(shù)量增加，腫瘤的發(fā)生率也逐漸增加，特別是在更新頻繁的組織中更加明顯，例如造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[7,8]。復(fù)制性衰老可能是影響EPC長期療效的重要因素，基于現(xiàn)有的理論和實驗結(jié)果，推測細(xì)胞凋亡過度是EPC衰老的原因之一[9]。p53是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子。SIRT1是組蛋白去乙?；窼irtuin家族的成員，參與了多種重要抗衰老基因的調(diào)控等諸多細(xì)胞活動[10]。SIRT1能對p53蛋白去乙?；?，從而使p53蛋白活性下降。miR-34a能抑制SIRT1及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CDK等的基因表達(dá)，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老，提示miR-34a在衰老的調(diào)控中可能發(fā)揮著重要的作用[1]?；罨蟮膒53也能增加miR-34a表達(dá)，miR-34a可通過抑制SIRT1的產(chǎn)生，而促進(jìn)p53的活化。由此推測，p53-miR-34a-SIRT1形成的正反饋環(huán)在細(xì)胞凋亡和增殖的過程中扮演者重要的角色。

本課題通過研究進(jìn)一步證實了EPC的復(fù)制性衰老，該衰老途徑與SIRT1對p53的去乙酰化相關(guān)；隨著細(xì)胞的傳代，SIRT1的表達(dá)減少，p53的活性增強，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控阻滯細(xì)胞周期，啟動細(xì)胞衰老和凋亡并降低了細(xì)胞的血管形成能力。外源性的miR-34a 抑制因子可減少SIRT1在EPC細(xì)胞分裂過程中的損失，保持細(xì)胞p53的活性，減少了EPC的凋亡并可達(dá)到延緩EPC衰老的進(jìn)程。因此，由p53-miR-34a-SIRT1構(gòu)成的正反饋環(huán)在EPC的復(fù)制性衰老過程中有著重要的意義，miR-34a 抑制因子可能是延緩EPC衰老的靶點，可為缺血性疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)，但其具體調(diào)控機制仍需進(jìn)一步研究。

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