鄭亞國，林松，張航，謝渡江，周陵，陳紹良

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種以肺動(dòng)脈內(nèi)膜增生、中膜肥厚及叢樣病變?yōu)樘卣鞯囊环N疾病[1]。PAH的發(fā)病機(jī)制與遺傳因素密切相關(guān)，目前指南把可遺傳性PAH單獨(dú)列為PAH的1個(gè)亞型。已知骨形成蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor 2, BMPR2)、活化素受體 類 激 酶 1（activin receptor-like kinase 1, ALK1）、Smad蛋 白 9（SMAD9）、 小 窩 蛋 白 l（caveolin-1,CAV-l)和鉀離子通道蛋白3（KCNK3）等多種基因突變和PAH發(fā)病有關(guān)[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，BMPR2是目前已知的最主要的PAH致病基因，約70%的可遺傳性PAH及26%的特發(fā)性PAH患者存在BMPR2基因突變，公共數(shù)據(jù)庫ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）共計(jì)報(bào)道了超過500個(gè)BMPR2的不同突變位點(diǎn)[3-5]。本研究中，我們利用全外顯子組測(cè)序方法對(duì)一個(gè)PAH家系進(jìn)行研究，以發(fā)現(xiàn)BMPR2基因的突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

研究對(duì)象：收集2016-11來本院就診的一個(gè)中國漢族PAH家系的資料， 3代共8人，所有成員均為江蘇籍漢族人，有2位已確診為PAH，其中男性1例（先證者），女性1例，為母子關(guān)系（圖1）。另選擇100名健康志愿者作為正常對(duì)照。PAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2015年歐洲心臟病學(xué)會(huì)PAH診治指南[1]。對(duì)所有家系成員進(jìn)行病史采集、體格檢查、心電圖及超聲心動(dòng)圖檢查，同時(shí)對(duì)先證者及超聲心動(dòng)圖懷疑PAH的家系成員進(jìn)行生化、免疫學(xué)檢查、六分鐘步行距離及右心導(dǎo)管檢查等更為詳盡的臨床評(píng)估。所有入選家系成員和健康志愿者均簽署知情同意書。

圖1 該肺動(dòng)脈高壓家系圖

標(biāo)本采集及DNA提?。哼x用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管分別收集本研究家系8名成員的外周靜脈血5 ml。按照DNA提取試劑盒（Qiagen, 德國）說明書提取基因組DNA。采用紫外分光光度法測(cè)定提取DNA的濃度與純度，-20℃分裝保存。

全外顯子組測(cè)序：先證者及其母親與先證者的父親及姨媽（正常者）作對(duì)照，進(jìn)行外顯子測(cè)序分析（諾禾致源，北京）。將基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長度為180～280 bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。帶有特異index的文庫pooling后與生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格即可運(yùn)用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

生物信息學(xué)分析：獲得原始測(cè)序序列后，在有參考序列或參考基因組（GRCh37/hg19）的情況下，進(jìn)行信息分析流程，大致包括以下三個(gè)部分：測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，變異檢測(cè)，變異篩選及與疾病相關(guān)性的預(yù)測(cè)。同時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，包括測(cè)序深度、覆蓋度均一性等分析。序列比對(duì)使用Burrows-Wheeler Aligner 軟件。在比對(duì)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們利用SAMtools識(shí)別SNP和InDel位點(diǎn)，并采用國際慣用的過濾標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行過濾。測(cè)序結(jié)果經(jīng)公共遺傳數(shù)據(jù)庫dbSNP138及千人基因數(shù)據(jù)庫過濾，去掉公共人群?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性突變和同義突變。剩余的突變根據(jù)ACMG開發(fā)的針對(duì)序列變異解讀的標(biāo)準(zhǔn)和指南對(duì)突變位點(diǎn)有害性進(jìn)行分類，留取致病性的變異位點(diǎn)及可能致病性的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析。再取2例患者突變的交集。

致病基因家系樣本測(cè)序驗(yàn)證：將數(shù)據(jù)分析后得到的可能的致病基因BMPR2的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，在其余4個(gè)家系成員及100名健康志愿者中進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增BMPR2基因的6號(hào)外顯子，引物由上海生工公司合成，引物序列為：BMPR2-EX6F：AAACACTTGCAGCTGATTGG；BMPR2-EX6R：TTACATTGGGATAGTACTCCATCAC。DNA樣 本經(jīng)PCR擴(kuò)增后在自動(dòng)測(cè)序儀ABI 3730XL Genetic Analyzer（賽墨飛，美國）上進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

臨床資料：先證者為14歲男性，因?yàn)榛顒?dòng)后胸悶、氣喘先后在三家醫(yī)院就診，查體發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈第二心音亢進(jìn)，心電圖示電軸右偏，肺性P波，右心室重度肥厚，超聲心動(dòng)圖示右心房、右心室擴(kuò)大，右心室壁增厚，室間隔左移，左心室呈“D”型，估測(cè)肺動(dòng)脈收縮壓91 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；右心導(dǎo)管測(cè)量右心房壓11 mmHg，肺動(dòng)脈收縮壓/舒張壓119/56 mmHg，肺動(dòng)脈平均壓77 mmHg，肺毛細(xì)血管鍥壓11 mmHg，心輸出量4.92 L/min，肺小動(dòng)脈阻力13.4 Wood units，急性肺血管擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)陰性，確診PAH后先后給予波生坦（125 mg，bid）、他達(dá)拉非（10 mg，qd）及貝前列素鈉片（60 μg，tid）治療。另一位確診的PAH患者為先證者母親，38歲，活動(dòng)后胸悶、氣喘10年，目前活動(dòng)耐力重度受限，心電圖示頻發(fā)室性早搏，電軸右偏，肺性P波，右心室重度肥厚，超聲心動(dòng)圖示右心房、右心室擴(kuò)大，估測(cè)肺動(dòng)脈收縮壓132 mmHg，隨訪至2017-03，患者母親死于右心衰竭。

全基因組外顯子測(cè)序結(jié)果：家系中2例患者（Ⅱ2，Ⅲ1）及兩名正常者（Ⅱ1，Ⅱ3）的外顯子測(cè)序結(jié)果見表1。我們?cè)?例患者的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了23 302及23 021個(gè)SNPs位點(diǎn)及629和582個(gè)編碼Indels。我們重點(diǎn)關(guān)注非同義突變位點(diǎn)、變異性剪接位點(diǎn)、插人和缺失的移碼突變位點(diǎn)，并排除在dbSNPl38數(shù)據(jù)庫及1 000 Genome Project數(shù)據(jù)庫中存在的突變位點(diǎn)。同時(shí)我們?nèi)?例患者的交集，經(jīng)過一系列篩選后剩下127個(gè)突變位點(diǎn)，包括114個(gè)SNPs和13個(gè)Indels。我們根據(jù)得到的結(jié)果，與已報(bào)道的遺傳學(xué)PAH相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在此家系中發(fā)現(xiàn)BMPR2基因6號(hào)外顯子747位點(diǎn)的移碼突變（BMPR2:NM_001204:e xon6:c.747_748insCCTTTGATGGAACATGA:p.V250fs）在2例PAH患者中均存在，在2名對(duì)照者中均不存在，很可能是該家系的致病基因。家系中的2例患者并不攜帶其他已知的與PAH相關(guān)的致病基因，如 CAV-1、ALK1、KCNK3、SMAD9、BMPR1B、ENG、MADH9及PPHR等。

BMPR2突變位點(diǎn)家系驗(yàn)證及擴(kuò)大樣本驗(yàn)證：為了確定BMPR2移碼突變（hg19 chr2: g.203383670G＞GCCTTTGATGGAACATGA）是該家系的致病基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)該突變位點(diǎn)的引物。并用Sanger測(cè)序法對(duì)該家系8個(gè)成員的DNA樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)2例患者均攜帶有BMPR2插入雜合突變，而家族其余成員均沒有該位點(diǎn)插入或缺失突變（圖2）。BMPR2插入雜合突變（c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA）在該家系中表現(xiàn)出與臨床表型的完全共分離。

表1 外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)

圖2 骨形成蛋白受體2基因突變位點(diǎn)DNA序列圖

我們進(jìn)一步在100名健康志愿者樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，未發(fā)現(xiàn)有BMPR2基因6號(hào)外顯子747位點(diǎn)的插入雜合突變。通過CADD軟件分析，該突變致BMPR2的250～256位氨基酸發(fā)生移碼突變（p.V250fs），并自257位終止；插入突變破壞了讀碼框，翻譯截短蛋白，從而造成BMPR2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能缺陷。因此，BMPR2基因6號(hào)外顯子747位點(diǎn)的插入雜合突變（c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA）是造成該家系患者肺動(dòng)脈高壓的遺傳學(xué)病因。

3 討論

目前認(rèn)為BMPR2基因突變引起B(yǎng)MPR2的功能缺陷是PAH的重要發(fā)病機(jī)制。BMPR2基因突變與PAH患者的臨床表型及預(yù)后密切相關(guān)。攜帶BMPR2基因突變的患者臨床表型更為嚴(yán)重，發(fā)病時(shí)間更早，血液動(dòng)力學(xué)改變更嚴(yán)重，急性肺血管擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)的陽性率更低，預(yù)后更差[6，7]。

在本研究中，我們利用高通量的二代測(cè)序技術(shù)對(duì)患者樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。全外顯子測(cè)序利用目標(biāo)序列捕獲技術(shù)將基因組的全部外顯子區(qū)域DNA捕獲后進(jìn)行高通量測(cè)序，不僅能快速發(fā)現(xiàn)罕見遺傳病的致病基因，也能用于多基因引起的常見疾病，從而揭示這些疾病的遺傳致病機(jī)理。目前全外顯子測(cè)序用于肺動(dòng)脈高壓的研究發(fā)現(xiàn)許多和肺動(dòng)脈高壓發(fā)病有關(guān)的新基因[8-10]。本研究中，我們?cè)谝粋€(gè)中國漢族PAH家系中發(fā)現(xiàn)了BMPR2基因6號(hào)外顯子747位點(diǎn)新的插入雜合突變位點(diǎn)（c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA）。目前6號(hào)外顯子上的已經(jīng)報(bào)道的和肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的突變包括無義突變（c.631C＞T）、錯(cuò)義突變（c.604A＞T、c.794A＞G、c.797G＞C 及 c.806G＞T）、剪接突變（c.852+1G＞C、c.853-1G＞C） 及 移 碼 突 變（c.612delA、c.690-691delAGinsT 及 c.673-679delCGTCCAG）[4,5]。

在此家系中，我們認(rèn)為，BMPR2基因插入雜合突變（c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA）導(dǎo)致PAH表型，主要基于以下證據(jù)：（1）該突變經(jīng)過外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)同時(shí)經(jīng)過Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并且在100名健康志愿者和dbSNP l38、千人基因數(shù)據(jù)庫中都未發(fā)現(xiàn)有該突變；（2）該突變?cè)诒炯蚁抵斜憩F(xiàn)出明顯的遺傳共分離現(xiàn)象，呈現(xiàn)常染色顯性遺傳特征，攜帶BMPR2基因突變的PAH患者是雜合子，等位基因中有一個(gè)是突變型，另一個(gè)是野生型；這與文獻(xiàn)報(bào)道的PAH遺傳特性一致；（3）BMPR2基因是一個(gè)目前公認(rèn)的PAH發(fā)病相關(guān)的基因，該突變位點(diǎn)附近的很多突變位點(diǎn)已經(jīng)被相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4,5]。（4）BMPR2突變致BMPR2 250位纈氨酸后發(fā)生移碼突變（p.V250fs），插入突變破壞了讀碼框，翻譯截短蛋白，從而造成BMPR2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能缺陷。因此，我們認(rèn)為該突變導(dǎo)致了PAH的發(fā)生。

該研究對(duì)于有家族史的患者，未常規(guī)使用一代測(cè)序排查常見致病基因突變，直接使用二代測(cè)序，最終發(fā)現(xiàn)的還是BMPR2基因上的突變，在一定程度上增加了科研經(jīng)費(fèi)支出。本研究報(bào)道了一個(gè)中國漢族人PAH家系，通過全外顯子組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了BMPR2基因的一個(gè)新的移碼突變位點(diǎn)（c.747_748.insCCTTTGATGGAACATGA）。該位點(diǎn)在該家系中表現(xiàn)出共性分離，是該家系PAH發(fā)生的遺傳學(xué)病因。本研究豐富了BMPR2基因的致病突變位點(diǎn)譜。

參考文獻(xiàn)

[1] Galie N, Humbert M, Vachiery J, et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension[J]. Eur Heart J,2015, 37(1): 67-119. DOI: 10. 1093/eurheartj/ehv317.

[2] 曾綺嫻, 熊長明. 肺動(dòng)脈高壓遺傳基因研究進(jìn)展 [J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 97(8): 632-634. DOI: 10. 3760/cma. j. issn. 0376-2491.2017. 08. 016.

[3] 趙林, 袁安慧, 王曉建, 等. 肺動(dòng)脈高壓遺傳修飾因素的研究進(jìn)展[J]. 中華心血管病雜志, 2016, 44(9): 817-820. DOI: 10. 3760/cma. j.issn. 0253-3758. 2016. 09. 020.

[4] Machado RD, Southgate L, Eichstaedt CA, et al. Pulmonary arterial hypertension: a current perspective on established and emerging molecular genetic defects[J]. Hum Mutat, 2015, 36(12): 1113-1127.DOI: 10. 1002/humu. 22904.

[5] Machado RD, Eickelberg O, Elliott CG, et al. Genetics and genomics of pulmonary arterial hypertension[J]. J Am Coll Cardiol, 2009, 54(1):S32-42. DOI: 10. 1016/j. jacc. 2009. 04. 015.

[6] Evans JD, Girerd B, Montani D, et al. BMPR2 mutations and survival in pulmonary arterial hypertension: an individual participant data meta-analysis[J]. Lancet Respir Med, 2016, 4(2): 129-137. DOI: 10.1016/S2213-2600(15)00544-5.

[7] Elliott CG, Glissmeyer EW, Havlena GT, et al. Relationship of BMPR2 mutations to vasoreactivity in pulmonary arterial hypertension[J].Circulation, 2006, 113(21): 2509-2515. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 105. 601930.

[8] Ma L, Roman-Campos D, Austin ED, et al. A novel channelopathy in pulmonary arterial hypertension[J]. N Engl J Med, 2013, 369(4): 351-361. DOI: 10. 1056/NEJMoa1211097.

[9] Eyries M, Montani D, Girerd B, et al. EIF2AK4 mutations cause pulmonary veno-occlusive disease, a recessive form of pulmonary hypertension[J]. Nat Genet, 2014, 46(1): 65-69. DOI: 10. 1038/ng.2844.

[10] 張建華, 許小毛, 鄒麗輝, 等. OR2T3基因與動(dòng)脈性肺動(dòng)脈高壓的關(guān)聯(lián)性分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 96(16): 1256-1260. DOI: 10.3760/cma. j. issn. 0376-2491. 2016. 16. 007.