李文超，梁啟超，鞏麗虹，倪丹蓉，汪洋，馮林旭，張朝立，高長久*

(1.牡丹江醫(yī)學院 藥學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.焦作市人民醫(yī)院，河南 焦作 454150)

蘆竹根Arundo Donax Rhizoma[1]，又名蘆荻頭、樓梯桿，為禾本科蘆竹屬植物蘆竹ArundodonaxL.的新鮮或干燥根莖，其入藥首載于《嶺南采藥錄》。蘆竹為蘆竹根的原植物，又名荻蘆竹(《本草匯言》)、綠竹(《分類草藥性》)，是一種全球分布較廣的植物，其資源豐富，廣泛分布于亞洲、歐洲南部、非洲北部以及中東地區(qū)。我國主要分布于西南、華南及江蘇、浙江、湖南等地。我國蘆竹多用于造紙工業(yè)[2]。蘆竹在歐洲與印度等地被用作結(jié)瘢劑、止血藥、回乳劑、止瀉藥、利尿藥，或用于治療牙疼、支氣管炎等[3-6]，藥用價值顯著。

蘆竹根微苦、味甘，性寒，具有清熱瀉火、止嘔生津、利尿通淋的功能[7]，主治熱病發(fā)狂、虛勞骨蒸、小便不利、淋病、風火牙痛等癥。臨床上主要用于治療小兒上呼吸道感染引起的高熱癥，療效確切，為中藥制劑蘆黃沖劑和去感熱注射液的主要原料藥材。蘆竹根主要化學成分為多種吲哚類生物堿，有降壓解痙作用，能拮抗組織胺、5-羥色胺、乙酰膽堿引起的痙攣[8-9]。因此，蘆竹根有較好的藥用開發(fā)價值。目前，國內(nèi)外主要報道了蘆竹根中生物堿的提取分離、結(jié)構(gòu)分析[10-12]等研究。K.A.Ubaidullaev等[13]對塔吉克斯坦的Shaartuz地區(qū)的蘆竹根地上部分采用三氯甲烷進行提取，反復氧化鋁柱層析分離得到3種吲哚類生物堿donaxine、donaxaridine和donaxarine，經(jīng)紅外光譜法、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振法對donaxaridine和donaxarine結(jié)構(gòu)進行確定。V.U.Khuzhaev等[14]對烏茲別克斯坦首都塔什干科學院植物園內(nèi)的蘆竹根采用三氯甲烷提取，同樣氧化鋁柱層析發(fā)現(xiàn)了之前得到的雙吲哚生物堿arundine(donaxine)，并采用紅外光譜法、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振法對其結(jié)構(gòu)進行確定，同時對其進行了合成。我國對蘆竹根的藥用研究一直滯后于國外，急需對其進行系統(tǒng)而深入的研究。2016年，劉清茹等[15]對蘆竹根的化學成分進行系統(tǒng)研究，采用不同色譜技術(shù)和重結(jié)晶等方法分離純化湖南瀏陽產(chǎn)蘆竹根化學成分，并通過理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。從其70%乙醇提取物中分離得到23個化合物。本實驗研究蘆竹根總生物堿的提取工藝，以期提高實際生產(chǎn)中的產(chǎn)率問題，為其市場開發(fā)創(chuàng)造條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Cary100雙光束紫外-可見分光光度儀(美國瓦里安公司)；AX200型電子天平(日本島津)；R205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物科技有限公司)。

1.2 材料

蘆竹根藥材購自四川省成都市，經(jīng)牡丹江市牡丹江醫(yī)學院藥學院高長久老師鑒定為蘆竹的根。

蘆竹堿對照品(沃凱，純度>97%，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130419)；乙醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、鹽酸、濃氨水(均市售分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆竹根藥材中總生物堿的含量測定

2.1.1 對照品儲備液的制備 取蘆竹堿對照品約50 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加入乙醇至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.198 mg·mL-1對照品儲備液。

2.1.2 測定波長的選擇 以乙醇為空白對照，將對照品溶液、樣品供試液和空白對照液在200～700 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，前兩者在210 nm和280 nm左右均有最大吸收，且在280 nm處吸收峰峰形較好，空白對照液在280 nm處幾乎沒有吸收，故本實驗選擇280 nm為測定波長，結(jié)果見圖1。

注：a.蘆竹堿對照品；b.供試品；c.空白溶液。圖1 波長掃描圖

2.1.3 標準曲線的制備 分別精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于10 mL容量瓶，乙醇定容至刻度。以乙醇為空白于280 nm測定吸光度值。以蘆竹堿對照品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，計算得回歸方程：Y=0.002 66+36.147 72X，r=0.999 9(n=8)，蘆竹堿在0.02～0.28 mg·mL-1與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 總生物堿的提取

將蘆竹根藥材粗粉100 g，加水浸泡2 h，煎煮1 h，紗布過濾，藥渣再煎煮一次。合并水煎液并濃縮，用乙醇調(diào)至含醇80%進行醇沉，靜置，過夜。抽濾，濾液濃縮以回收乙醇。醇浸膏用濃氨水堿化至pH 10以上，用三氯甲烷萃取2～3次。合并三氯甲烷層并將三氯甲烷層移入250 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，即得供試液。吸取供試液5.0 mL于干燥的250 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，以無水乙醇為參比，在280 nm處測定吸光度。

2.3 總生物堿含量的測定

精密量取不同批次蘆竹根總生物堿提取物3份，按2.1.1的方法制備樣品溶液和空白對照液，在280 nm處分別測定吸光度并計算其總生物堿平均含量。

2.4 總生物堿提取的單因素試驗考察

2.4.1 含醇量的確定 稱取100 g粗粉，每次煎煮1 h，7倍液量，煎煮2次，過濾，收集濾液。將總濾液分成6等份濃縮，分別使溶液含醇量至90%、80%、70%、60%、40%、30%，制得供試品溶液。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.4.2 提取時間的確定 稱取100 g粗粉6份，煎煮2次，7倍液量，含醇量80%，分別煎煮0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h共制得供試品溶液6份。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.4.3 提取次數(shù)的確定 稱取100 g粗粉，每次煎煮1 h，7倍液量，含醇量80%，煎煮1次后，連續(xù)煎煮上次濾渣，煎煮4次，制得供試品溶液。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.4.4 提取液體積的確定 稱取100 g粗粉5份，每次煎煮1 h，煎煮2次，含醇量80%，分別在提取液體積5倍、6倍、7倍、8倍、9倍(如500 mL一定濃度的乙醇每100 g藥材)條件下，制得樣品溶液。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.5 正交試驗設(shè)計優(yōu)選

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為了確定蘆竹根總生物堿的最佳提取工藝，根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果選取液料比(A)、煎煮次數(shù)(B)、煎煮時間(C)、含醇量(D)為考察因素，以總生物堿含量為考察指標，采取L9(34)正交表試驗探索最佳試驗條件。各因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗考察結(jié)果與分析

3.1.1 含醇量的確定 由圖1可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與含醇量的高低有著密切關(guān)系。當含醇量增大時，總生物堿提取率隨之提高，當含醇量高于80%提取率趨于平緩，實際操作過程中在含醇量80%左右時，易于萃取，分離層明顯。

圖2 不同醇沉含醇量提取比較

3.1.2 提取時間的確定 由圖2可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與煎煮時間的長短有關(guān)系。蘆竹根總生物堿提取率隨著時間延長而增大，當煎煮時間在1.5 h后，曲線上升趨于平緩。因此煎煮時間1.5～3.0 h在實驗時間內(nèi)。

圖3 不同煎煮時間提取比較

3.1.3 提取次數(shù)的確定 由圖3可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與提取次數(shù)有關(guān)系。在4次提取過程中，吸光度值隨著次數(shù)的增加而減少，在第三、第四次提取時，吸光度值變化很小，說明總生物堿已完全提取出來。

圖4 煎煮次數(shù)對含量的影響

3.1.4 提取液體積的確定 由圖4可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與液料比有關(guān)系。蘆竹根總生物堿的提取率隨著提取液的增加而增加，當液料比6以上時，液料比對提取蘆竹根總生物堿的影響較小，在一定體積的溶劑已將有效成分基本溶出完全。

圖5 提取液體積對含量的影響

3.2 正交試驗設(shè)計結(jié)果與分析

3.2.1 正交試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果 為了確定蘆竹根總生物堿的最佳提取工藝，根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果選取料液比(A)、煎煮次數(shù)(B)、煎煮時間(C)、醇沉含醇量(D)為考察因素，以總生物堿含量為考察指標，采取L9(34)正交表探索最佳試驗條件。蘆竹根總生物堿提取工藝條件的正交試驗設(shè)計及其結(jié)果見表2。

表2 蘆竹根總生物堿提取工藝條件的正交試驗設(shè)計及其結(jié)果

由直觀分析可知，以蘆竹根總生物堿的提取含量為考察指標，表2中R值可以看出，各因素對試驗結(jié)果的影響大小順序為D>C>B>A，即醇沉含醇量>煎煮時間>煎煮次數(shù)>液料比，A最佳條件為A2，即液料比為7∶1。以影響最小的液料比為誤差項，進行三因素方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 蘆竹根總生物堿提取率方差分析

注：F0.10(2，2)=9.00。

3.2.2 正交試驗方差分析及其結(jié)果 由表3正交試驗方差分析結(jié)果得出，D因素的影響有顯著性意義，B和C因素則無顯著性影響。D最佳條件為D1(90%含醇量)。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定蘆竹根最佳提取工藝為A2B2C2D1，即液料比為7∶1；煎煮次數(shù)為3次；煎煮時間2 h；含醇量為90%。從極差、方差和實際操作過程中含醇量80%時，萃取效果最好，分層明顯，乳化現(xiàn)象少，且可以節(jié)省很多乙醇，為實際的工業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本。煎煮2次即可達到目的，減少能源消耗。綜合分析結(jié)果可以得出，最佳提取工藝為液料比7∶1、含醇量80%、煎煮時間2 h、煎煮次數(shù)2次。

3.2.3 驗證實驗 分別取3份蘆竹根100 g，按最佳工藝條件平行操作，液料比7∶1、含醇量80%、煎煮時間2 h、煎煮次數(shù)2次。合并提取液，過濾，濃縮，定容。測定并計算3份蘆竹根中總生物堿的含量。結(jié)果見表4。

表4 最佳工藝條件驗證結(jié)果

由表4得知，用最佳工藝條件提取，提取率高于正交試驗中最高一組數(shù)據(jù)，所以這組最佳工藝條件合理。

4 討論

蘆竹根化學成分主要為多種吲哚類生物堿，有著較好的藥物開發(fā)價值。本文采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化水煎法提取蘆竹根中總生物堿的工藝。通過正交試驗直觀分析得到各因素對蘆竹根中總生物堿提取影響的大小順序D>C>B>A，即含醇量>煎煮時間>煎煮次數(shù)>液料比。正交試驗方差分析結(jié)果得出，D因素的影響有顯著性意義，D最佳條件為D1。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，以及試驗具體過程和節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，確定蘆竹根中總生物堿最佳提取工藝為A2B2C2D1，即液料比為7∶1；煎煮次數(shù)為3次；煎煮時間2 h；含醇量為80%。驗證實驗用最佳工藝條件提取，提取物得到的提取率高于正交試驗中最高一組數(shù)據(jù)，所以這組最佳工藝條件合理。本試驗所得到的工藝條件可行性強、工藝簡單，能為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，為蘆竹資源進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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