羅麗，李會娟，魏雪蘋，2，魏建和，劉海濤，2，李曉瑾，樊叢照，張本剛，2，齊耀東，2*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 中藥資源教育部工程研究中心，北京 100193；3.新疆維吾爾自治區(qū) 中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

百合科貝母屬FritillariaL.物種豐富，全世界約140種，主要分布于北半球溫帶地區(qū)[1-3]，屬下常分為8個亞屬：貝母亞屬Subg.Fritillaria、多花亞屬Subg.Rhinoptalum、Subg.Japonica、單鱗亞屬Subg.Theresia、聚花亞屬Subg.Petilium、多鱗亞屬Subg.Liliorhiza、Subg.Davidii、Subg.Korolkowia[1]。中國約有24種[4]，分別屬于貝母亞屬、多花亞屬、多鱗亞屬。我國貝母屬植物按照分布區(qū)域劃分，通常分為橫斷山區(qū)及鄰近地區(qū)貝母群、長江中下游地區(qū)貝母群、新疆地區(qū)貝母群[5-8]，其中新疆是一個相對獨立分布區(qū)域，本區(qū)域分布的該屬物種在我國其他地區(qū)沒有分布。該地區(qū)貝母屬植物約有9種[9]，除砂貝母為多花亞屬外，其余8種均屬貝母亞屬。貝母為傳統(tǒng)藥材，具清熱化痰、止咳散結的功效，其來源為貝母屬植物[10]。新疆地區(qū)分布的新疆貝母F.walujewii、伊犁貝母F.pallidiflora被《中華人民共和國藥典》收錄為伊貝母基原，然而我們的野外調查和文獻報道[11]均表明，當地大多數貝母屬物種均作伊貝母使用。

植物親緣關系是植物類群在系統(tǒng)發(fā)生上顯示的演化關系，在一定程度上是藥用植物生物學本質的具體體現(xiàn)[12]，形態(tài)性狀與分子標記相結合的方法是研究植物親緣關系的重要手段。形態(tài)學方面，前人對新疆地區(qū)貝母屬物種葉、花粉、莖[13-16]顯微特征及核型[17-18]進行了研究。分子標記方面：Cai等[19]，Wang等[20]用RFLP的分子標記對貝母屬部分物種的鑒定進行了研究；王果平等[21]和詹羽嬌等[22]均利用ISSR探討了新疆貝母屬植物的遺傳多樣性，結果存在差異。R?nsted等[23]用matK、rpl16、ITS三個片段對貝母屬及百合屬構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，賴宏武等[24]也選用這三個片段聯(lián)合對長江中下游地區(qū)貝母屬物種親緣關系進行了研究，Day等[25]選用matK、rpl16、rbcL和11對低拷貝核基因探究了貝母屬93個物種間的進化關系，構建了貝母屬的屬下系統(tǒng)發(fā)育框架。但是上述研究或者焦點未集中在親緣與進化探究，或者對新疆地區(qū)分布的物種取樣不足。因此，對新疆地區(qū)貝母屬物種的親緣關系尚不明確。肖培根等[26]認為親緣關系相近的物種生物活性和療效往往有很大的相似性，該地區(qū)貝母屬物種能否作為同一類貝母藥材使用，分子系統(tǒng)學的研究能夠為其親緣關系提供數據支持。基于前人研究結果[23-25，27-29]，我們選用葉綠體基因片段matK、rpl16和核基因間隔區(qū)ITS，探討該地區(qū)貝母屬物種親緣關系，為該地區(qū)貝母類藥材的合理使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選取17個物種，貝母屬包含新疆地區(qū)分布的7個物種、東北地區(qū)分布的1個物種，橫斷山區(qū)及鄰近地區(qū)分布的2個物種，共21個居群，其中16個為野生，5個為栽培。所用實驗樣品均為硅膠干燥的新鮮葉片；另有7個物種的序列來自GenBank。采集信息及序列號詳見表1。

表1 樣品詳細信息及GenBank登錄號

表1(續(xù))

1.2 植物總DNA提取

根據植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.China)說明書進行提取，提取后產物置于-20 ℃條件下保存，用于目標序列的擴增。

1.3 引物設計合成

實驗選用葉綠體片段matK、rpl16，nrDNA-ITS進行擴增，引物信息見表2，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 引物信息

1.4 PCR擴增與測序

利用表2中ITS、matK、rpl16引物在BIO-RAD PCR儀中進行樣品PCR擴增，反應體系25μL，包括：2×Taq PCR Master Mix12.5 μL(北京艾德萊生物科技有限公司)，2.5 μmol·L-1引物各1 μL，樣品總DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。

擴增程序：94 ℃預變性(ITS 3min ；matK，rpl16 5 min)；94 ℃變性1 min，退火1 min(ITS 58 ℃；matK 53 ℃，rpl16 54 ℃)，72 ℃延伸(ITS 2 min；matK 2.5 min，rpl16 2 min)(34個循環(huán))，72 ℃延伸(ITS 5 min；matK 7 min，rpl16 5 min)，12 ℃保存。

1.5 序列測序

PCR產物經純化后直接測序，其中ITS有雙峰的序列，克隆測序得到的多條序列，均用于后續(xù)分析。測序由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 序列分析

測序序列用CodonCode Aligner v.3.7(Codon Code Corporation，Dedham，MA，USA)進行拼接，拼接后的序列結合GenBank下載序列在BioEdit v.7.0.9.0[34]中進行手工排序。以大百合Cardiocrinumgiganteum、大葉假百合Notholirionmacrophyllum、川百合Liliumdavidi為外類群，用最大似然法(Maximum likelihood，ML)、最大簡約法(Maximum parsimony，MP)、貝葉斯分析法(Bayesian inference，BI)分別構建葉綠體聯(lián)合、ITS片段系統(tǒng)發(fā)育樹。ML分析在RAxML網絡版[35]中完成；MP分析利用PAUP v.4.0[36]完成；BI分析利用MrBayes v.3.2[37]完成。利用jModelTest v.2.1.7[38]評估ITS、葉綠體聯(lián)合片段在ML、BI分析中的最適核苷酸替代模型分別為GTR+G、TIM1+G。ML分析自展值(bootstrap value，BSML)通過快速自展式搜索(rapid bootstrap search)100次得到。MP分析中，目標核苷酸性狀等同加權，gap作缺失處理，用每步增加一棵樹的方法，任意重復1000次進行啟發(fā)式搜索，TBR分枝交換法獲取系統(tǒng)樹，得到的系統(tǒng)樹分支的可靠性評價使用自展分析，1000 次重復取樣，1000次隨機序列加入，最后得到MP自展值(BSMP)。BI分析采用馬爾科夫鏈蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)方法，以隨機樹為起始樹，運行100 000 0代，每1000代取樣1次。舍棄10%的老化樣本后，對其余所有的樹計算其多數一致樹，最后獲得各分枝的后驗概率(posterior probability，PPBI)。

2 結果

2.1 序列信息

實驗共測得ITS序列35條，matK、rpl16各23條。貝母屬屬下物種ITS序列長度為503～634 bp，排列長度為636 bp，變異位點為67個，信息位點48個；matK序列長度和排序長度均為1235 bp，變異位點為48個，信息位點39個；rpl16序列長度為904～953 bp，排列長度為983 bp，變異位點為38個，信息位點30個。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹重建

2.2.1matK、rpl16聯(lián)合分析matK、rpl16聯(lián)合數據構建的3種系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構一致，本文僅展示了BI系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

圖1 采用BI構建的mat K、rpl 16數據系統(tǒng)發(fā)育樹

結果顯示：在系統(tǒng)發(fā)育樹中貝母屬物種構成具有較高支持的一支(BSML=87/BSMP=71/PPBI=1.00)，砂貝母和額敏貝母、平貝母構成Ⅰ支，砂貝母的不同個體構成亞支a(BSML=100/BSMP=100/PPBI=1.00)、平貝母和額敏貝母構成亞支b(BSML=100/BSMP=98/PPBI=1.00)，二者均為單系。分支Ⅱ分成兩個亞支c(BSML=80/BSMP=67/PPBI=0.93)、d(BSML=89/BSMP=63/PPBI=1.00)。亞支c包含長江中下游(湖北貝母、浙貝母)和橫斷山區(qū)及附近地區(qū)貝母群(川貝母、甘肅貝母、太白貝母、暗紫貝母)，二者分別構成單系；亞支d為新疆地區(qū)貝母群(新疆貝母、伊犁貝母、裕民貝母、托里貝母、黃花貝母)。在亞支d中，同物種內不同個體分別聚為單系，新疆貝母位于基部，為該地區(qū)其他物種的姐妹群；而伊犁貝母與裕民貝母、黃花貝母、托里貝母組成姐妹群。

2.2.2 ITS序列分析 ITS數據構建的ML、MP、BI系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構基本一致，本文僅展示了BI系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。結果顯示：基于ITS數據構建的系統(tǒng)發(fā)育樹與基于葉綠體數據構建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構略有差異：ITS數據顯示貝母屬物種構成單系，但支持率較低(BSML<50/BSMP=79/PPBI<0.70)；在亞支d中，新疆地區(qū)貝母群同物種內不同個體不聚成單系；且黃花貝母、托里貝母、裕民貝母、伊犁貝母和新疆貝母種間和種內個體相互嵌入。

注：“-”示BSML/BSMP <50，PPBI <0.70。圖2 采用BI構建的mat K、rpl 16 ITS聯(lián)合數據系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 新疆地區(qū)貝母屬物種親緣關系

目前對于新疆地區(qū)貝母屬物種親緣關系的研究較少，僅王果平等人[21]、詹羽嬌等人[22]利用ISSR分析做過較為全面的研究，但二者的結論有所差異：王果平等人認為該地區(qū)該物種分為四類，第一類為新疆貝母、伊犁貝母、裕民貝母，第二類為塔城貝母(裕民貝母變種)、大白花貝母(黃花貝母變種)、托里貝母、小白花貝母(黃花貝母變種)、黃花貝母，第三類額敏貝母，第四類砂貝母；同一類的物種親緣關系較近。詹羽嬌等人則分為另外四類，第一類新疆貝母、伊犁貝母，第二類大白花貝母、托里貝母、黃花貝母，第三類額敏貝母、裕民貝母，第四類砂貝母。裕民貝母的歸類存在明顯爭議。本研究利用ITS、葉綠體數據構建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持新疆地區(qū)貝母屬物種主要分為三群：伊犁貝母、新疆貝母與托里貝母、黃花貝母、裕民貝母為一群(新疆地區(qū)貝母群)；額敏貝母與東北地區(qū)的平貝母構成一群；砂貝母為單獨一支。這與Day等人[25]利用matK、rpl16、rbcL構建的貝母屬8個亞屬代表物種系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構一致。形態(tài)上[4，9]，新疆貝母群物種植株高大、花絲均無小乳突，區(qū)別于額敏貝母、平貝母和砂貝母植株矮小、花絲具小乳突特征；額敏貝母與平貝母均為紫花又能很好地與砂貝母粉花區(qū)分；此外砂貝母其獨有特征，如全株被乳突狀毛，花粉外壁紋飾擬腦紋型[14]。這些形態(tài)特征很好地支持了其在系統(tǒng)樹上的位置，表明了托里貝母、黃花貝母、裕民貝母與伊犁貝母、新疆貝母親緣關系較近；額敏貝母、砂貝母與伊犁貝母、新疆貝母親緣關系較遠。

3.2 三個片段的在貝母屬系統(tǒng)發(fā)育分析中適用性

葉綠體基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，新疆地區(qū)貝母群很好地聚為一支，5個物種的多個個體各自構成單系；而ITS構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，同樣支持新疆地區(qū)貝母群聚為一支，但物種間沒有分辨率，且同一物種不同個體或同一個體不同拷貝相互穿插，物種間無法有效區(qū)分。研究表明，葉綠體和核基因系統(tǒng)發(fā)育樹存在沖突可能的原因包括雜交、基因滲入，不完全譜系分選、基因重復等[39-40]。本研究的這種不一致一方面可能是新疆地區(qū)貝母群物種間存在上述現(xiàn)象導致，另一方面可能與貝母屬物種基因組巨大、復雜[41]、ITS存在多個拷貝和協(xié)同進化有關。R?nsted等人[23]在貝母屬和百合屬的研究中也存在類似情況。因此，貝母屬屬下分類與鑒定研究中，葉綠體基因比ITS更為適合，深入理解貝母屬的親緣關系和物種形成還需要更多的核基因數據。

3.3 新疆地區(qū)貝母屬物種作為貝母藥材使用合理性

植物的親緣關系、化學成分與療效間存在潛在關聯(lián)[26，42-44]，物種間親緣關系、化學成分的比較研究有助于發(fā)現(xiàn)植物的藥用價值，開發(fā)新的藥用植物資源[45]。貝母為多基原藥材，植物親緣關系研究、化學成分比較對其臨床用藥安全、有效及新基原資源開發(fā)具有重要意義。研究表明，貝母類藥材鎮(zhèn)咳平喘的活性成分為總生物堿[46]，單體成分貝母甲素verticine、貝母乙素verticinone、西貝素imperialine、西貝素苷imperialine-β-Dglucoside和貝母辛peimisine等具有良好的鎮(zhèn)咳平喘的作用[47-48]，西貝素及西貝素苷還作為伊貝母藥典檢測成分[10]。結合本研究親緣關系探究結果，該研究有以下觀點。

新疆地區(qū)貝母群 本研究表明裕民貝母、托里貝母、黃花貝母與伊貝母的基原植物伊犁貝母和新疆貝母具有較近的親緣關系。已有的化學成分研究表明新疆貝母群的5個物種均含有貝母乙素、西貝素、西貝素苷3種生物堿類成分[49-52]。因此，裕民貝母、托里貝母、黃花貝母具有作伊貝母藥材使用的潛在可能。

額敏貝母 在系統(tǒng)發(fā)育樹上，額敏貝母與東北分布的平貝母互為姐妹支，而與新疆地區(qū)其它貝母屬物種親緣關系較遠。其化學成分研究相對較少，僅張鵬葛等[53-54]報道額敏貝母含有生物堿類化合物，但其含量均低于新疆地區(qū)其它貝母屬植物，單體化合物尚未報道，因此從化學成分上難以判斷是否可作為貝母類藥材使用。

砂貝母 在系統(tǒng)發(fā)育樹上，砂貝母也與新疆地區(qū)其它貝母屬物種親緣關系較遠，與額敏貝母、平貝母共同構成中國貝母類群的基部分支?；瘜W成分的研究顯示砂貝母的生物堿含量僅高于額敏貝母，低于新疆地區(qū)其它貝母屬物種[53-54]，目前也僅報道西貝素一個單體成分[55]，從化學成分上也難以判斷是否可作為貝母類藥材使用。

4 結論

通過系統(tǒng)發(fā)育樹的重建發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)分布的黃花貝母、托里貝母、裕民貝母、伊犁貝母、新疆貝母親緣關系較近；額敏貝母與東北地區(qū)分布的平貝母親緣關系較近，砂貝母與之互為姐妹群，位于基部。伊貝母藥材兩基原植物親緣關系相近的3個物種，含有與之相同的有效成分，有作為伊貝母藥材使用的潛在可能，作為貝母類藥材使用較為合理；額敏貝母和砂貝母與伊貝母藥材兩基原親緣關系較遠，作為伊貝母使用值得商榷；額敏貝母與平貝母互為姐妹關系，但其化學成分研究相對較少，能否作為平貝母藥材使用有待進一步研究。

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