張思荻，賴月月，楊超，卿艷，李敏*，周娟*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611000)

魚(yú)腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜HouttuyniacordataThunb.的新鮮全草或干燥地上部分，《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)自1963年版開(kāi)始收載，延載至今，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功能，用于肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒[1]，還具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的作用，是傳統(tǒng)大宗中藥材之一。現(xiàn)代研究顯示，魚(yú)腥草中的化學(xué)成分有揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸、生物堿等類成分，是魚(yú)腥草水溶性成分中的主要藥效物質(zhì)，其中黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗衰老、保肝、提高免疫力、治療心血管疾病、防治糖尿病等多種生物學(xué)活性[2-9]。

目前市場(chǎng)上有90%以上含有魚(yú)腥草的中成藥，在制劑工藝中對(duì)魚(yú)腥草進(jìn)行水煎煮或乙醇提取處理，其主要藥效物質(zhì)為黃酮類成分。《中國(guó)藥典》2015年版僅規(guī)定魚(yú)腥草水溶性浸出物不得少于10.0%，但未明確相關(guān)的藥效成分的含量測(cè)定指標(biāo)。筆者研究發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的82批次魚(yú)腥草浸出物合格率高達(dá)100%，但其主要藥效成分之一的黃酮類成分差異較大，亟需建立主要藥效成分之一的黃酮類成分的含量分析方法及標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究結(jié)合不同市場(chǎng)、不同產(chǎn)區(qū)的實(shí)際生產(chǎn)，采用HPLC建立了測(cè)定魚(yú)腥草中金絲桃苷和槲皮苷含量的質(zhì)量控制方法，以期通過(guò)控制2個(gè)活性成分的含量達(dá)到對(duì)魚(yú)腥草藥效的有效控制，同時(shí)分析評(píng)價(jià)魚(yú)腥草質(zhì)量，為客觀評(píng)價(jià)魚(yú)腥草品質(zhì)提供依據(jù)，增補(bǔ)《中國(guó)藥典》魚(yú)腥草標(biāo)準(zhǔn)的空白，以實(shí)現(xiàn)魚(yú)腥草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，為魚(yú)腥草標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 樣品收集

本研究收集了不同來(lái)源的魚(yú)腥草共計(jì)82批。其中，2017年8月1—20日收集道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)樣品51批(編號(hào)：YC-1～YC-51)，于2017年2月16—19日收集市場(chǎng)樣品31批(編號(hào)：YC-52～YC-82)。所有樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為三白草科植物蕺菜HouttuyniacordataThunb.的干燥地上部分，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器

高效液相色譜儀Aglient 1260(包括二元高壓泵系統(tǒng)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、TUV檢測(cè)器、Aglient軟件色譜工作站)；BP-121s精密電子天平(十萬(wàn)分之一，浙江精密儀器有限公司)；BS-200S-WEI精密電子天平(千分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

表1 魚(yú)腥草樣品收集信息表

1.3 試劑

乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑(甲醇，磷酸等)均為分析純，水為超純水。

對(duì)照品：金絲桃苷(批號(hào)：MUST-16102605，純度：99.76%，成都曼斯特生物科技有限公司)，槲皮苷(批號(hào)：111538-201606，純度：90.60%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

2 方法

2.1 色譜條件

Waters SunfireC18色譜柱(250 mm4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(18∶82)，流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm，柱溫：30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.26 mg，槲皮苷對(duì)照品10.87 mg，分別加50%甲醇水配制成質(zhì)量濃度為0.102 6、0.108 7 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取魚(yú)腥草樣品粉末0.1 g(過(guò)三號(hào)篩)，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

取金絲桃苷和槲皮苷對(duì)照品適量，加50%甲醇水分別配制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，分別以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，得金絲桃苷回歸方程為Y=179 465X+201.82，r=0.999 9，線性范圍0.008 656～0.173 12 mg·mL-1；槲皮苷回歸方程為Y=182 474X+239.51，r=0.999 9，線性范圍0.011 73～0.234 6 mg·mL-1。結(jié)果表明兩者線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄金絲桃苷和槲皮苷的色譜峰面積，計(jì)算峰面積RSD值分別為1.15%、0.43%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置并分別于0、4、8、16、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，記錄金絲桃苷和槲皮苷的色譜峰面積，計(jì)算峰面積RSD值分別為1.15%、0.47%，表明魚(yú)腥草供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的魚(yú)腥草樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，記錄金絲桃苷和槲皮苷的色譜峰面積，計(jì)算峰面積RSD值分別為2.6%、0.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一已測(cè)定含量的魚(yú)腥草(YC-46)粉末6份(每份約0.05 g)，精密稱定，每份精密加入相同量的金絲桃苷和槲皮苷對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，金絲桃苷的平均回收率為109.63%，RSD=1.86%；槲皮苷平均回收率為105.55%，RSD=1.52%。

2.9 樣品測(cè)定

取魚(yú)腥草粉末按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，按照干品計(jì)算魚(yú)腥草中金絲桃苷和槲皮苷的含量。色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.供試品；B.對(duì)照品；1.金絲桃苷；2.槲皮苷。圖1 魚(yú)腥草及對(duì)照品HPLC圖

3 結(jié)果與分析

測(cè)定不同來(lái)源的82批次魚(yú)腥草的金絲桃苷和槲皮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.04%～0.86%，平均值為0.28%；槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.10%～2.58%，平均值為0.59%；2個(gè)黃酮的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.14%～3.45%，平均值為0.87%。由此可見(jiàn)，不同來(lái)源的魚(yú)腥草藥材中的金絲桃苷和槲皮苷含量存在較大差異。

由表3可以看出，不同產(chǎn)地(道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū))、不同市場(chǎng)的魚(yú)腥草中金絲桃苷和槲皮苷的含量均存在較大差異，但以市場(chǎng)樣品之間的差異小于道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)樣品之間的差異。整體而言，道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)樣品中金絲桃苷、槲皮苷和兩者的總量均高于市場(chǎng)樣品。

3.1 道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)魚(yú)腥草質(zhì)量分析

由圖2可知，不同產(chǎn)地的魚(yú)腥草中金絲桃苷和槲皮苷總含量由高到低依次是貴州、廣西、云南、四川、重慶、湖北、江西、福建。

以表2中金絲桃苷和槲皮苷的含量為影響因素進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果見(jiàn)圖3，類間距離等于5時(shí)，8個(gè)產(chǎn)地的魚(yú)腥草共分為3類，貴州道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)樣品為第1類，廣西產(chǎn)樣品為第2類，四川、云南、重慶、福建與湖北等道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)樣品聚為第3類。上述產(chǎn)地中，貴州和福建魚(yú)腥草均為野生樣品，其余產(chǎn)地既有野生品又有栽培品。由聚類分析可知，同一資源類型、不同產(chǎn)地的魚(yú)腥草之間存在較大差異，與其生長(zhǎng)環(huán)境有重要的聯(lián)系，其中貴州、廣西、云南、四川產(chǎn)的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)魚(yú)腥草含量整體較其他產(chǎn)地高，適宜于魚(yú)腥草的種植。

3.2 不同資源類型魚(yú)腥草質(zhì)量分析

由表2和表3可知，不同資源類型魚(yú)腥草中金絲桃苷和槲皮苷的含量存在較大差異，以野生品之間的差異大于栽培品之間的差異。不同產(chǎn)地同一資源類型、同一產(chǎn)地同一資源類型間魚(yú)腥草中金絲桃苷、槲皮苷的含量均值皆存在明顯差異。整體而言，野生魚(yú)腥草中金絲桃苷、槲皮苷和兩者的總量均高于栽培魚(yú)腥草，說(shuō)明不同生長(zhǎng)年限的種莖對(duì)魚(yú)腥草中黃酮類成分的含量有一定的影響。

表2 不同來(lái)源魚(yú)腥草金絲桃苷和槲皮苷含量測(cè)定結(jié)果

表3 魚(yú)腥草藥材中金絲桃苷和槲皮苷含量范圍及均值

圖2 不同來(lái)源魚(yú)腥草中金絲桃苷、槲皮苷以及2個(gè)成分含量總和柱狀圖

圖3 不同產(chǎn)地魚(yú)腥草系統(tǒng)聚類圖

4 討論

黃酮類成分是魚(yú)腥草中的主要活性成分之一，與其清熱解毒、消癰排膿等功效密切相關(guān)。目前能通過(guò)指紋圖譜[10-11]體現(xiàn)出來(lái)的黃酮類成分有蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、異槲皮苷、槲皮素，本研究選取含量之和高于5個(gè)黃酮總量80%的2個(gè)黃酮金絲桃苷和槲皮苷，作為測(cè)定指標(biāo)具有一定的科學(xué)合理性，可用于有效控制魚(yú)腥草的質(zhì)量。金絲桃苷和槲皮苷均屬于黃酮醇類化合物[12-13]，作用相似，以金絲桃苷和槲皮苷總量作為限度檢測(cè)指標(biāo)較為適宜，能更科學(xué)合理地控制魚(yú)腥草的質(zhì)量。

不同來(lái)源的魚(yú)腥草之間金絲桃苷和槲皮苷的含量均存在差異，整體而言，道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)樣品中金絲桃苷和槲皮苷的含量高于市場(chǎng)樣品。造成這種差異的原因有很多，其中貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短以及貯藏條件的選擇，可能是造成其含量低于產(chǎn)地樣品的重要原因，市場(chǎng)樣品流通量大，一般大量堆放貯藏時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致魚(yú)腥草有效成分含量降低。此外，市場(chǎng)上魚(yú)腥草的采收時(shí)間和加工方法大多根據(jù)農(nóng)戶的意愿以及企業(yè)的需求進(jìn)行采收，沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)范，也是影響魚(yú)腥草質(zhì)量的重要因素。對(duì)收集的不同產(chǎn)地魚(yú)腥草的資源類型進(jìn)行比較，其金絲桃苷、槲皮苷的含量均值以及兩者總量，均以野生品高于栽培品。這種差異的形成可能與魚(yú)腥草種莖的生長(zhǎng)時(shí)間有密切的聯(lián)系，野生魚(yú)腥草種莖生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)，物質(zhì)積累較多，而栽培魚(yú)腥草種莖多為1年生種莖，物質(zhì)積累較少。此外，種植模式也是引起栽培魚(yú)腥草低于野生魚(yú)腥草的重要因素。據(jù)筆者調(diào)查，全國(guó)魚(yú)腥草基地幾乎全部以生產(chǎn)蔬菜(地下部分)為主，地上藥用部分僅為副產(chǎn)品。部分地區(qū)農(nóng)戶在魚(yú)腥草生長(zhǎng)中期施入大量生長(zhǎng)控制劑抑制地上部分生長(zhǎng)，從而使其根系快速生長(zhǎng)，得到優(yōu)質(zhì)粗壯的種莖以獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益，必然影響魚(yú)腥草的質(zhì)量。

本研究結(jié)合市場(chǎng)和各個(gè)主產(chǎn)區(qū)等實(shí)際流通生產(chǎn)過(guò)程，從樣品收集的完整性和代表性、標(biāo)準(zhǔn)研究的先進(jìn)性以及規(guī)范性方面，建立了同時(shí)測(cè)定金絲桃苷和槲皮苷含量的方法，具有快速、簡(jiǎn)便、保留時(shí)間短、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能有效地從源頭上評(píng)價(jià)并控制魚(yú)腥草的質(zhì)量，填補(bǔ)了《中國(guó)藥典》含量測(cè)定的空白，為中藥標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)中魚(yú)腥草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究提供了數(shù)據(jù)支持。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：224.

[2] 趙雪巍，劉培玉，劉丹，等.黃酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46(21)：3264-3271.

[3] 楊楠，賈曉斌，張振海等.黃酮類化合物抗腫瘤活性及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(3)：373-381.

[4] 李丹，彭成，謝曉芳.黃酮類化合物治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(11)：239-242.

[5] 康亞蘭，裴瑾，蔡文龍，等.藥用植物黃酮類化合物代謝合成途徑及相關(guān)功能基因的研究進(jìn)展[J].中草藥，2014，45(9)：1336-1341.

[6] 王立萍，王新春.黃酮類化合物的代謝研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(11)：226-229.

[7] 何潔，何芮，嚴(yán)奉偉.魚(yú)腥草總黃酮的提取方法與抗氧化活性研究[J].食品科技，2014，39(3)：198-201.

[8] 蔡文國(guó)，吳衛(wèi)，代沙，等.不同種質(zhì)魚(yú)腥草總酚、黃酮含量及其抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2013，34(7)：42-46.

[9] 龔乃超.魚(yú)腥草黃酮類化合物的提取純化及抗抑郁作用的研究[D].武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2009.

[10] 楊國(guó)榮.魚(yú)腥草和甜茶中總黃酮的提取及抗過(guò)敏活性研究[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2005.

[11] 何兵，劉艷，田吉，等.指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)模式在中藥魚(yú)腥草質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(16)：2682-2689.

[12] 張穎.魚(yú)腥草黃酮類有效成分的提取與精制[D].天津：天津大學(xué)，2007.

[13] 陳金印，張坤，徐敏，等.山核桃樹(shù)皮中槲皮苷的提取工藝優(yōu)選及含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(22)：42-45.