張 莉，劉 騰，繆秋紅，唐井玉，朱 杰，董丹丹，陳宗艷，王桂軍，劉光清，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

天然免疫是機(jī)體與生俱來的對病原微生物的天然抵抗力，在天然免疫中存在著由宿主細(xì)胞產(chǎn)生并能抑制或干擾病毒生命活動(dòng)的因子，這些因子被稱為天然免疫限制因子。目前，已被發(fā)現(xiàn)的天然免疫限制因子有APOBEC3、TRIM5α、SAMHD1、MOV10和BST-2(bone marrow stromal cell antigen 2)。其中，BST-2是宿主細(xì)胞中最關(guān)鍵的防御因子之一，它能夠抑制不同的囊膜病毒從宿主細(xì)胞上的釋放及傳播[1]。

BST-2又被稱為CD317、HM1.24、Tetherin，最早發(fā)現(xiàn)于終末分化的B細(xì)胞表面，在腫瘤細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀漿細(xì)胞中都有表達(dá)。2008年，研究人員首次證明BST-2的抗病毒活性，BST-2能夠抑制HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)病毒粒子的釋放[2]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)，BST-2對其他一些囊膜病毒也存在一定的限制作用，這其中包括埃博拉病毒[3]、馬爾堡病毒[4]、甲型流感病毒[5-7]、仙臺(tái)病毒[8-9]、拉沙熱病毒[10]、丙型肝炎病毒[11]等。

目前，對BST-2的研究主要集中在靈長類動(dòng)物上，而對羊源BST-2的研究較少。已有研究證實(shí)，綿羊BST-2對囊膜病毒出芽存在限制作用，因此推測山羊BST-2也有此作用。本研究對山羊BST-2基因進(jìn)行了克隆，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化了羊源BST-2蛋白，在此基礎(chǔ)上探討了BST-2蛋白在Vero細(xì)胞上的亞細(xì)胞定位情況。本研究對進(jìn)一步研究山羊BST-2蛋白的生物學(xué)功能及其對羊源囊膜病毒的抗病毒功能提供了一定基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、SolutionⅠ購自TaKaRa公司。Trans2k plusⅡDNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司。去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ均購自于NEB公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 2000購自Invitrogen公司。DMEM、胎牛血清、PBS均購自于Hyclone公司。Opti-MEM購自Gibco公司。抗Flag標(biāo)簽小鼠單克隆抗體、抗GST標(biāo)簽鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自Santa Cruz公司。ECL顯色試劑盒購自賽默飛公司。

1.2 細(xì)胞及質(zhì)粒

E.coliTrans 5α、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Vero細(xì)胞系、p3×Flag-CMV-14、pGEX-4T-1、pUC-BST-2質(zhì)粒均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 重組質(zhì)粒pGEX-BST-2、p3×Flag-BST-2的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中的預(yù)測山羊BST-2基因CDS區(qū)序列(XM_018051380.1)，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)2對擴(kuò)增BST-2基因的特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為495 bp。引物序列如下：BST-2-Flag-F，5’-CCCAAGCTTATGATGGACAAATTGGAAGGATCT-3’(下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn))；BST-2-Flag-R，5’-GCTCTAGATTTCTTCAGACACTTGCGGGT-3’(下劃線處為XbaⅠ酶切位點(diǎn))； BST-2-GST-F，5’-CGCGGATCCATGATGGACAAATTG GAAGGA-3’(下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；BST-2-GST-R，5’-CCGGAATTCATTTCTTCAGACACTTGCG-3’(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

以pUC-BST-2重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，分別用BamHⅠ和EcoRⅠ、HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，然后分別與用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切的載體pGEX-4T-1及HindⅢ和XbaⅠ雙酶切的載體p3×Flag-CMV-14進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTrans 5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定正確提取重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送至上海華津生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 重組蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pGEX-BST-2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)。待D600達(dá)到0.6～0.8后，加入1 mmol·L-1IPTG于16 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。確認(rèn)目的蛋白表達(dá)后，再進(jìn)行蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)，4 ℃離心收集菌體，經(jīng)過溶菌酶、反復(fù)凍融、超聲波處理后，離心獲得上清，按照GST-Sefinose resin GST試劑盒說明書進(jìn)行目的蛋白的純化。

1.5 Western blot鑒定重組蛋白

重組蛋白BST-2經(jīng)SDS-PAGE電泳后，半干法轉(zhuǎn)印至NC膜上，使用含5%脫脂乳的TBST 4 ℃封閉過夜。加入1∶1 000稀釋的抗GST標(biāo)簽的鼠源單克隆抗體4 ℃孵育過夜。清洗后加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，使用ECL顯色試劑盒顯色。

1.6 Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

采用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)Vero細(xì)胞，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，在無血清條件下，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)置陰性對照組。轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，激光共聚焦顯微鏡下觀察BST-2蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行Western blot鑒定BST-2的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-BST-2、p3×Flag-BST-2的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增片段大小約在495 bp(圖1)，與預(yù)期大小一致。重組質(zhì)粒pGEX-BST-2、p3×Flag-BST-2分別經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ及HindⅢ和XbaⅠ雙酶切，得到與預(yù)期大小一致的載體片段及目的基因片段。測序結(jié)果表明，目的基因BST-2已被插入pGEX-4T-1和p3×Flag-CMV-14質(zhì)粒中。

2.2 重組蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-BST-2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果，誘導(dǎo)后出現(xiàn)分子質(zhì)量約為42 ku的特異性蛋白，與預(yù)期大小一致(圖2)。未誘導(dǎo)的空載體和重組表達(dá)載體的菌株未表達(dá)目的條帶。本研究中原核表達(dá)的重組BST-2蛋白含有GST標(biāo)簽，使用抗GST標(biāo)簽的特異性抗體對目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要在表達(dá)菌上清(圖3)。

2.3 Western blot鑒定真核表達(dá)BST-2蛋白

真核表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-BST-2轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot鑒定BST-2蛋白的表達(dá)。本研究中真核表達(dá)重組蛋白含有Flag標(biāo)簽，使用抗Flag的鼠源單克隆抗體作為一抗，Western blot結(jié)果顯示，融合蛋白BST-2已成功表達(dá)，大小約為21 ku，與預(yù)期目的蛋白大小一致。

M，蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pGEX-BST-2未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2～6，pGEX-BST-2在16、20、24、28、32 h內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；7，空載體未經(jīng)誘導(dǎo)；8，空載體誘導(dǎo)；9，純化的重組蛋白。M，Protein molecular weight marker; 1，Before induced pGEX-BST-2; 2-6，The plasmid pGEX-BST-2 induced in 16，20，24，28，32 h; 7，pGEX-4T-1 without induction; 8，pGEX-4T-1induced with IPTG; 9，Purified recombinant protein.圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of recombinant protein by SDS-PAGE

M，蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pGEX-BST-2誘導(dǎo)上清；2，pGEX-BST-2誘導(dǎo)沉淀。M，Protein molecular weight marker; 1，Supernatant of induced pGEX-BST-2; 2，Sediment of induced pGEX-BST-2.圖3 Western blot鑒定原核表達(dá)BST-2蛋白Fig.3 Identification of the prokaryotic expression BST-2 protein by Western blot

2.4 BST-2蛋白的亞細(xì)胞定位

真核表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-BST-2轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，激光共聚焦顯微鏡下觀察BST-2蛋白的亞細(xì)胞定位情況。IFA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒p3×Flag-BST-2在Vero細(xì)胞中，綠色熒光主要在細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有綠色熒光，而細(xì)胞核中沒有綠色熒光顯現(xiàn)，陰性對照組未見綠色熒光。結(jié)果表明，BST-2蛋白主要在Vero細(xì)胞膜表達(dá)。

M，蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，真核表達(dá)BST-2蛋白。M，Protein molecular weight marker; 1，The eukaryotic expression BST-2 protein.圖4 Western blot鑒定真核表達(dá)蛋白Fig.4 Identification of the eukaryotic expression BST-2 protein by Western blot

A，轉(zhuǎn)染p3×Flag-BST-2的Vero細(xì)胞(40×)；B，陰性對照(40×)。A，Vero cells transfected with p3×Flag-BST-2(40×);B，Negative control(40×).圖5 BST-2蛋白在Vero細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of BST-2 protein in Vero cells

3 討論

BST-2是一種能夠被Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的跨膜蛋白，包含4個(gè)區(qū)域，分別是N端胞質(zhì)尾區(qū)(CT)、跨膜區(qū)(TM)、胞外螺旋區(qū)和C端糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn)(GPI)。BST-2的跨膜區(qū)和GPI形成了其特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這與它的抗病毒活性密切相關(guān)。BST-2能夠抑制多種囊膜病毒的出芽及釋放，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些病毒粒子具有拮抗BST-2功能的蛋白，例如HIV-1的Vpu蛋白能通過不同的策略拮抗BST-2的抗病毒活性[2]，SIV的Nef蛋白下調(diào)細(xì)胞表面的BST-2表達(dá)量來發(fā)揮拮抗作用[12]，EIAV的Env蛋白能夠拮抗馬BST-2的抗病毒活性且呈現(xiàn)種屬特異性[13]。

本研究克隆了羊源BST-2基因，并成功用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了融合GST標(biāo)簽的BST-2蛋白。此外，將含有BST-2基因的真核表達(dá)載體p3×Flag-BST-2轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，對其在細(xì)胞中的表達(dá)定位進(jìn)行了初步分析，結(jié)果顯示，該蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，這可能與其具有跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，這也決定了BST-2具有在細(xì)胞膜上限制病毒釋放的生物學(xué)功能。雖然大量研究表明，BST-2能夠發(fā)揮抗病毒功能，但非靈長類動(dòng)物BST-2的抗病毒活性以及病毒拮抗BST-2研究較少，本研究獲得了原核表達(dá)的BST-2蛋白，為制備抗BST-2的多克隆抗體提供了前期準(zhǔn)備，成功構(gòu)建真核表達(dá)BST-2蛋白的載體能研究其與羊源囊膜病毒各個(gè)蛋白的相互作用，這些都為深入探究山羊BST-2抗病毒機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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