張 青，肖文斐，裘劼人，陳初尉，忻 雅，柴偉國，阮松林，*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州310024； 2.杭州市臨安區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311300)

植物免疫誘導(dǎo)劑又稱植物疫苗，主要通過激發(fā)植物自身的免疫抗性，使其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，從而達(dá)到抑制病原菌的目的，具有防病、增產(chǎn)、改善品質(zhì)等功效。免疫誘導(dǎo)劑可分為非生物來源和生物來源兩大類。無機(jī)鹽、有機(jī)酸、寡糖類、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等為非生物源的誘導(dǎo)劑，而生物來源的誘導(dǎo)劑包括有源自植物的寡聚半乳糖、源自細(xì)菌的過敏素(harpin) 、病毒衣殼蛋白、糖蛋白類等。自2000年以來，國內(nèi)外相繼開發(fā)出了商品化的免疫誘導(dǎo)劑，如美國Eden Bioscienes公司的Messenger、Redox Chemicals公司的Oxycom、Morse公司的KeyPlex、中國科學(xué)院的殼寡糖、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的寡糖鏈蛋白(阿泰靈)等[1]。近年來，杭州市農(nóng)科院植物免疫誘抗劑研發(fā)團(tuán)隊(duì)利用含生物活性鉀的免疫增效分子(IEM)與殼寡糖復(fù)合成功研制出新型高效免疫誘抗劑——?？奠`1號(hào)，該制劑在水稻、玉米、葡萄、黃瓜、西瓜等作物上應(yīng)用表現(xiàn)出抗病和促生長功效[2-5]，主要表現(xiàn)能夠促進(jìn)葉片生長，增加葉片面積和厚度；提高葉綠素含量，促進(jìn)光合作用增強(qiáng)；提高抗病性相關(guān)酶如苯丙氨酸解氨酶活性，對(duì)靶標(biāo)病原菌的防效達(dá)60%～95%；提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)；可減施農(nóng)藥量30%以上，促進(jìn)品質(zhì)提升和食用安全性提高。

黑李屬于薔薇科李屬，從美國引進(jìn)，因果的顏色是紫黑色而得名，又稱其為美國黑李，是美國布朗李優(yōu)質(zhì)品種之一，樹勢強(qiáng)旺、早結(jié)豐產(chǎn)，含豐富蛋白質(zhì)、維生素及多種礦物質(zhì)，色味極佳，既適合鮮食，又適合加工果干、果醬、蜜餞、罐頭等產(chǎn)品，市場前景好。為了研究免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)對(duì)黑李葉片生長的影響，我們檢測誘導(dǎo)劑處理后黑李葉片的大小、厚度、葉綠素及多酚氧化酶指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，?？奠`1號(hào)處理后葉片變大變厚，葉綠素含量和多酚氧化酶活性增加，明顯促進(jìn)葉片生長。目前，在如桃、銀杏和杏仁等其他李屬物種上有關(guān)于果實(shí)軟化、自交不親和、果仁蛋白等蛋白質(zhì)組學(xué)方面的報(bào)道[6-8]，但在黑李的生長發(fā)育方面尚未見蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)報(bào)道。但是。為了揭示免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)對(duì)黑李葉片的誘導(dǎo)促生長作用，本文擬從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)層次研究誘導(dǎo)劑保康靈1號(hào)處理后黑李葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及蛋白質(zhì)組的變化，試圖找出促長相關(guān)的功能基因及關(guān)鍵途徑，將有助于揭示其對(duì)黑李葉片的誘導(dǎo)促生長機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以黑李品種黑寶石李為試材，在浙江省杭州市臨安區(qū)秀水闊灘紅梅農(nóng)莊種植基地內(nèi)進(jìn)行。該基地黑李種植面積3 335 m2，地勢平坦，土壤肥力均衡，土質(zhì)為砂壤土。株齡4年，株距1 m，行距2.6 m，為拱圓式東西向連棟棚架避雨栽培，每個(gè)拱形棚寬2.6 m，頂高3.5 m，側(cè)高1.8 m，每個(gè)拱形棚種植一行，每行35株。每年2月下旬至3月初覆薄膜進(jìn)行避雨，10月下旬除去薄膜。各試驗(yàn)植株生長勢相對(duì)一致，樹勢均中庸，栽培管理水平較好。免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫誘導(dǎo)劑處理

自2017年4月初開始，試驗(yàn)設(shè)?？奠`1號(hào)和清水對(duì)照處理。每一處理選取2行進(jìn)行噴施，每隔15 d噴施1次，連噴3次。然后隨機(jī)采集每一處理(共10株)20片葉片，對(duì)其葉片面積、葉片厚度、葉綠素含量和多酚氧化酶活性進(jìn)行測定。另取10片葉片，裝入離心管，置于超低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葉片面積和厚度測定

隨機(jī)選取部位相同的10張黑李葉片，重復(fù)3次，利用葉面積儀(YMJ-B，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司)測定葉片面積，同時(shí)利用厚度儀(YH-1，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司)測定葉片厚度。

1.2.3 葉片橫切面番紅固綠染色觀察

(1)制作切片。固定，葉片組織于固定液中固定 3～5 d；修塊，從固定液中取出組織，修整為適當(dāng)?shù)男螤罴昂穸?；脫水，組織塊經(jīng)過 80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅲ進(jìn)行脫水處理；透明，二甲苯Ⅰ 30 min、二甲苯Ⅱ 20 min；浸蠟，石蠟Ⅰ1 h、石蠟Ⅱ3 h；包埋，按照取材面向下的原則，用石蠟包埋起組織，待蠟塊冷卻凝固后置于-20 ℃冷藏；切片，切片厚度4 μm；烤片：切片放入65 ℃恒溫箱中6～12 h；保存，裝盒，常溫保存。

(2)番紅-固綠染色。二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-100%乙醇Ⅰ5 min-100%乙醇Ⅱ5 min-95%乙醇 5 min-80%乙醇 5 min-PBS洗3次，每次3 min；番紅-固綠染色，0.1%番紅染液染色30 min，自來水洗1 min，0.5%固綠染色1 min，自來水洗1 min；脫水、透明、封固，80%乙醇0.5 min、95%乙醇Ⅰ0.5 min、95%乙醇Ⅱ0.5 min、無水乙醇Ⅰ0.5 min、無水乙醇Ⅱ0.5 min、二甲苯Ⅰ透明3 min、二甲苯Ⅱ透明3 min，取出后用中性樹膠封片，拍照。

(3)數(shù)據(jù)處理。顯微鏡下找到組織，隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照。用Image-Pro Plus軟件測量葉片的上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織的細(xì)胞和組織的整體厚度，每個(gè)樣本各測量3次，結(jié)果以平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.2.4 葉綠素含量測定

稱取黑李葉片0.25 g且重復(fù)3次，置于研缽中，加入5 mL 95%乙醇與少許石英砂，充分研磨至組織變白，再加入10 mL 95%乙醇，沖洗研缽后轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)，靜止3～5 min，定容至15 mL，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液用95%乙醇定容至15 mL；取提取液1 mL，加95%乙醇4 mL，以95%乙醇為空白對(duì)照，用UV-2550型分光光度計(jì)測定波長665 nm、649 nm、470 nm下的吸光度，按公式計(jì)算葉綠素含量。

1.2.5 多酚氧化酶活(PPO)性測定

多酚氧化酶酶液的提取及活性測定參照邱德文[9]方法進(jìn)行。稱取0.1 g葉片，加1.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH 6.8)磨成勻漿，離心后取0.5 mL上清，加50 mmol·L-1兒茶酚1.5 mL，2 mL磷酸緩沖液，40 ℃水浴1 h，525 nm測量吸光值。以每克鮮質(zhì)量每小時(shí)的D值大小表示酶活力。

1.2.6 黑李葉片總蛋白的提取

稱取新鮮黑李葉片0.5 g，用液氮研磨成粉末，裝入10 mL離心管中，迅速加入5 mL預(yù)冷的蛋白提取液Ⅰ(含10%三氯乙酸的丙酮溶液)進(jìn)行沉淀粗蛋白(-20 ℃，1 h)期間晃勻5～6次，4 ℃下13 000 r·min-1離心20 min。取沉淀，加入10 mL預(yù)冷的蛋白提取液Ⅱ(含0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液)(-20 ℃，1 h)清洗，4 ℃下13 000 r·min-1離心20 min。再重復(fù)清洗2次。取沉淀，真空抽干得粗蛋白干粉。用裂解液UTC (7 mol·L-1尿素，10 mmol·L-1DTT，2 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF)溶解沉淀，室溫放置1 h(渦旋5～6次)。取上清得蛋白樣品，用改良型Bradford法測定試劑盒(酶標(biāo)法)測定蛋白濃度。

1.2.7 還原烷基化和蛋白酶解

取150 μg蛋白樣品于1.5 mL EP管并加入100 mmol·L-1NH4HCO3至100 μL，加入11 μL 100 mmol·L-1的二硫蘇糖醇(DTT)使其終濃度為10 mmol·L-1，適度旋渦，放于37 ℃的金屬浴上反應(yīng)1 h。加入12 μL 500 mmol·L-1的IAA使其終濃度為50 mmol·L-1左右，避光室溫反應(yīng)30 min。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至超濾管中，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。棄收集管中廢液，再向超濾管中加入150 μL 100 mmol·L-1NH4HCO34 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。重復(fù)清洗1次。更換新的收集管，超濾管中加入100 mmol·L-1NH4HCO3至總體積為100 μL，按照蛋白質(zhì)量∶Trypsin=25∶1的比例加入Trypsin(1 μg·μL-1)，于37 ℃金屬浴上過夜(12～16 h)。然后于4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，再向超濾管中加入100 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3重復(fù)離心1次即得肽段溶液。

1.2.8 除鹽

在上述肽段溶液中加入5%三氟乙酸(TFA)至其終濃度為0.1%～1.0%，使肽段酸化。將C18 tip 緊密固定在100 μL移液器上，吸取100 μL 50% 乙晴(CAN)后打出，重復(fù)一次以潤濕C18填料。吸取吹打0.1%TFA 2次以平衡C18 tip。吸取吹打肽段樣品50次以達(dá)到最佳吸附效果。吸取吹打0.1% TFA/5% ACN 10次以清洗肽段樣品。依次緩慢吸取50 μL 0.1% TFA至50%、60%、70%、80% ACN以洗脫肽段，并將洗脫液收集到新的1.5 mL EP管中。得到終體積200 μL的樣本，真空旋轉(zhuǎn)抽干。加入80 μL 0.1% TFA適當(dāng)渦旋溶解，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中上機(jī)檢測。

1.2.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

利用Easy-nano LC 1000液相儀和Q Exactive質(zhì)譜儀(ThermoScientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析。保護(hù)柱，Acclaim PepMap 100(75 μm內(nèi)徑×2 cm長，3 μm顆粒C18)；分析柱，Acclaim PepMap RSLC(50 μm內(nèi)徑×15 cm長，3 μm顆粒C18)；液相梯度，0～4min，4%～7% B；4～66 min，7%～14%B；66～88 min，14%～19%B；88～104 min，19%～34%B；104～120 min，34%～84% B(A，0.1%FA，H2O；B，0.1%FA，ACN)。噴針電壓2.0 kV，毛細(xì)管溫度320 ℃，S-lens 55%，碰撞能量27% HCD。分辨率設(shè)置，一級(jí)70 000@m/z 200，二級(jí) 17 500@m/z 200；母離子掃描范圍 m/z 300～2 000；子離子掃描范圍m/z 100。以DDA模式(Data-dependent)采集前20(TOP20)的肽段。

1.2.10 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

原始文件(raw file)使用 Maxquant 軟件(版本1.6.0.1)進(jìn)行Label-free定性和定量分析，搜索李屬、薔薇科和綠色植物等物種的蛋白數(shù)據(jù)庫。具體搜庫參數(shù)如下：前體離子質(zhì)量偏差10×10-6；碎片離子質(zhì)量偏差25 mmu ；固定修飾，半胱氨酸(Cysteine)烷基化(+57.021 Da)；動(dòng)態(tài)修飾，甲硫氨酸(Methionine)氧化；乙?；?N-端)；酶trypsin；漏切位點(diǎn)2。數(shù)據(jù)庫來自 UNIPROT(http：//www.uniprot.org/)。

1.2.11 差異蛋白篩選

利用Perseus軟件(版本1.6.0.2)分析差異蛋白質(zhì)。有效值過濾條件，最小有效值為3。采用2個(gè)樣品測驗(yàn)：Welch test S0=2 both side；Permutation based FDR=0.01 report q-value；Number of randomizations=250；-log10(Pvalue)。數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)：-log Welch’s T-testP-value>1.3 (即Pvalue<0.05)；Welch’s T-test Difference>0.585(即fold change>1.5) ；或 Welch’s T-test Difference<-0.585(即fold change<2/3)。

1.2.12 GO分類和KEGG途徑分析

利用DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)開源軟件分析GO分類和KEGG途徑。參數(shù)設(shè)置：分析組件DAVID Functional Annotation Tool；閾值(minimum count)為2，EASE為0.1；顯示Benjamini。根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫中的各蛋白GO注釋，并結(jié)合其來源，人工選擇鑒定所得到的蛋白最可能的細(xì)胞成分、分子功能和生物學(xué)途徑，并對(duì)其進(jìn)行基因富集度計(jì)算和圖示化。

1.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖

所有葉片形態(tài)與生理數(shù)據(jù)均采用DPS 7.0軟件分析方差及顯著性，百分率數(shù)據(jù)在方差分析前經(jīng)反正弦平方根轉(zhuǎn)換，然后通過SSR法比較處理間的差異性。所有圖中直方柱上顯示小寫字母的顯著性在0.05水平，而顯示大寫字母的顯著性在0.01水平。本文中所有圖均采用Sigmaplot 10.0軟件作圖獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫誘導(dǎo)劑與對(duì)照處理的黑李葉片表型比較分析

為了研究免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)對(duì)黑李葉片表型的影響，我們比較分析免疫誘導(dǎo)劑與對(duì)照處理布朗李葉片大小、厚度等性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，免疫誘導(dǎo)劑保康靈1號(hào)處理后葉片明顯變大(圖1-A)，葉面積增加(圖1-B)，葉片變厚(圖1-C)。進(jìn)一步對(duì)葉片橫切面進(jìn)行觀測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)處理后葉片柵欄組織、海綿組織和下表皮明顯增厚，而上表皮無明顯變化(圖1-D和表1)，說明免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)處理后葉片內(nèi)柵欄組織、海綿組織和下表皮的厚度增加，從而使葉片明顯變厚。

2.2 免疫誘導(dǎo)劑處理對(duì)黑李葉片葉綠素含量和多酚氧化酶活性的影響

為了明確免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)處理后黑李葉片變化的生理生化基礎(chǔ)，我們測定了黑李葉片葉綠素含量和多酚氧化酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)處理后葉片葉綠素含量(圖2-A)和多酚氧化酶活性(圖2-B)明顯增加，說明免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)處理后具有促進(jìn)黑李葉片光合作用和誘導(dǎo)抗病的潛在作用。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量分析

為了從蛋白質(zhì)組學(xué)水平上揭示免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)對(duì)黑李葉片促生長作用，我們對(duì)免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)和對(duì)照處理黑李葉片蛋白的質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行多庫搜索分析，共鑒定770個(gè)蛋白質(zhì)。然后利用Perseus軟件，并結(jié)合Welch’s t-test篩選出157個(gè)差異蛋白(圖3-A)，其中上調(diào)蛋白75個(gè)(上調(diào)1.5倍且P<0.05)，下調(diào)蛋白82個(gè)(下調(diào)1.5倍且P<0.05)(圖3-B)。

A，葉片表型；B，葉片面積；C，葉片厚度；D，葉片橫切面；a，上表皮；b，柵欄組織；c，海綿組織；d，下表皮。A，Phenotype of leaf；B，Leaf area；C，Leaf thickness；D，Blade transverse section；a，Upper epidermis；b，Palisade tissue；c，Spongy tissue；d，Lower epidermis.圖1 免疫誘導(dǎo)劑處理與對(duì)照的黑李葉片大小和厚度比較Fig.1 Comparison of size and thickness of leaves treated with immunity inducer and control

表1 免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)對(duì)黑李葉片組織厚度的影響Table 1 Effect of immunity inducer Baokangling No.1 on thickness of black plum leaf tissue

同一列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
The values in the same column with different lowercase letters showed the significant difference(P<0.05).

2.4 共同差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO分類

2.4.1 差異上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)GO

我們對(duì)75個(gè)差異上調(diào)蛋白(或基因)進(jìn)行細(xì)胞組分、分子功能及生物過程等方面的GO分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14個(gè)差異蛋白(或基因)被富集并指定分布在6個(gè)細(xì)胞組分中，包括液泡膜(GO:0005774)、植物型細(xì)胞壁(GO:0009505)、葉綠體(GO:0009507)、甘氨酸裂解復(fù)合體(GO:0005960)、葉綠體被膜(GO:0009941)和葉綠體基質(zhì)(GO:0009570)。20個(gè)差異蛋白(或基因)被富集并指定具有4種分子功能，包括鈣離子結(jié)合(GO:0005509)、轉(zhuǎn)錄共阻遏物的活性(GO:0003714)、金屬離子結(jié)合(GO:0046872)和半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑的活性(GO:0004869)。有4個(gè)差異蛋白(或基因)被富集并參與2種生物過程，包括通過甘氨酸裂解系統(tǒng)的甘氨酸脫羧(GO:0019464)和氧脂素生物合成過程(GO:0031408)(表2)。

圖2 免疫誘導(dǎo)劑處理與對(duì)照的黑李葉片葉綠素含量(A)和多酚氧化酶活性(B)比較Fig.2 Comparison of chlorophyll content (A) and PPO activity (B) of black plum leaves treated with immunity inducer and control

A，火山圖顯示的差異蛋白，淺灰色點(diǎn)表示上調(diào)1.5倍且P<0.05的蛋白，黑色點(diǎn)表示下調(diào)1.5倍且P<0.05的蛋白；B，差異上調(diào)和下調(diào)蛋白數(shù)量。A，Volcano plot of differential proteins. Light grey dots represent proteins with up to 1.5 fold and P<0.05. Black dots represent proteins with down to 1.5 fold and P<0.05; B，The number of differentially up-regulated and down-regulated proteins.圖3 在免疫誘導(dǎo)劑處理與對(duì)照的黑李葉片中差異表達(dá)蛋白數(shù)量Fig.3 Number of differential expression proteins of black plum leaves treated with immunity inducer and control

2.4.2 差異下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)GO

同樣，我們對(duì)82個(gè)差異下調(diào)蛋白(或基因)進(jìn)行細(xì)胞組分、分子功能及生物過程等方面的GO分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異蛋白(或基因)被富集并指定分布在5個(gè)細(xì)胞組分中，包括葉綠體基質(zhì)(GO:0009570)、葉綠體被膜(GO:0009941)、光系統(tǒng)Ⅰ(GO:0009522)、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ(GO:0005747)和非原質(zhì)體(GO:0048046)。47個(gè)差異蛋白(或基因) 被富集并指定具有9種分子功能，包括氧化還原酶活性(GO:0016491)、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性(GO:0004807)、作用于酯鍵的水解酶活性(GO:0016788)、L-蘋果酸脫氫酶活性(GO:0030060)、黃素單核苷酸結(jié)合(GO:0010181)、輔酶NADP結(jié)合(GO：0050661)、核酮糖二磷酸羧化酶的活性(GO:0016984)、絲氨酸內(nèi)肽酶活性(GO:0004252)和甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0004372)。有42個(gè)差異蛋白(或基因)參與11種生物過程，包括生物刺激反應(yīng)(GO:0009607)、光合作用(GO:0015979)、糖酵解過程 (GO:0006096)、碳水化合物代謝過程(GO:0005975)、蘋果酸代謝過程(GO:0006108)、防御反應(yīng)(GO:0006952)、四氫葉酸轉(zhuǎn)換(GO:0035999)、甘氨酸的代謝過程(GO:0006544)、碳固定(GO:0015977)、光呼吸作用(GO:0009853)和L-絲氨酸的代謝過程(GO:0006563)(表3)。

表2 差異上調(diào)基因GO分類Table 2 GO classification of differentially up-regulated genes

表3 差異下調(diào)基因GO分類Table 3 GO classification of differentially down-regulated genes

2.5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG分析

2.5.1 差異上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG分析

為了明確75個(gè)差異上調(diào)蛋白(或基因)功能，我們對(duì)其進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有34個(gè)差異上調(diào)蛋白(或基因)被富集并指定參與10個(gè)途徑，包括核苷酸切除修復(fù) (ath03420)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝 (ath00260)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(ath04070、osa04070、gmx04070、pxb04070、mdm04070、zma04070、sot04070、zma04070)、剪接體(ath03040、sly03040)、過氧化物酶體(vvi04146、sly04146、osa04146、ath04146)、氧化磷酸化(fve00190、ath00190)、光合作用-天線蛋白(pxb00196)、光合作用(ath00195)、氨酰tRNA生物合成(vvi00970)和亞油酸代謝(mdm00591)(圖4-A)。

2.5.2 差異下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG分析

同樣，我們對(duì)82個(gè)差異下調(diào)蛋白(或基因)進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有51個(gè)差異下調(diào)蛋白(或基因)被富集并指定參與14個(gè)途徑，包括乙醛酸和二羧酸代謝(ath00630)、植物-病原菌互作(ath04626)、精氨酸生物合成(osa00220)、檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán))(ath00020)、光合作用(sly00195、sot00195、zma00195、ath00195、tcc00195、fve00195、pxb00195)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(ath00260、sot00260)、過氧化酶體(zma04146、osa04146、ath04146、sly04146)、糖酵解/糖異生(ath00010、osa00010、zma00010)、嘌呤代謝(osa00230、ath00230)、淀粉和蔗糖代謝(ath00500)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工(rcu04141)、α-亞麻酸代謝 (osa00592)、半乳糖代謝(ath00052)和核糖體 (ath03010)(圖4-B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，免疫誘導(dǎo)劑保康靈1號(hào)處理后黑李葉片明顯變大，葉面積增加，葉片變厚，葉綠素含量和多酚氧化酶活性增加。葉片橫切面顯示，誘導(dǎo)劑處理后葉片內(nèi)柵欄組織、海綿組織和下表皮明顯增厚。眾所周知，葉片內(nèi)葉綠體主要分布于柵欄組織和海綿組織中，因此，我們認(rèn)為誘導(dǎo)劑處理后葉片內(nèi)柵欄組織和海綿組織增厚，不僅能夠引起葉片變厚，而且可能導(dǎo)致葉綠素含量增加。

A，差異上調(diào)基因途徑分析；B，差異下調(diào)基因途徑分析。A，Pathway analysis of differentially up-regulated genes； B，Pathway analysis of differentially down-regulated genes.圖4 差異表達(dá)基因途徑分析Fig.4 Pathway analysis of differentially expressed genes

差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明，無論是差異上調(diào)蛋白還是差異下調(diào)蛋白GO分類均被指定與葉綠體有關(guān)，差異上調(diào)蛋白主要分布在葉綠體、葉綠體膜和葉綠體基質(zhì)中，而差異下調(diào)蛋白主要分布在葉綠體基質(zhì)、葉綠體被膜和光系統(tǒng)Ⅰ。代謝途徑分析結(jié)果表明，無論是差異上調(diào)蛋白還是差異下調(diào)蛋白均被富集并指定參與光合作用。因此，我們認(rèn)為免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)通過調(diào)節(jié)黑李葉片光合作用相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)葉片生長發(fā)育。除光合作用途徑外，其他共同途徑如甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝和過氧化物酶體也均出現(xiàn)在差異上調(diào)蛋白和差異下調(diào)蛋白途徑分類上，只是基因及其表達(dá)程度不同，說明免疫誘導(dǎo)劑保康靈1號(hào)對(duì)這些途徑的蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)保持平衡。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)有4個(gè)上調(diào)蛋白β-半乳糖苷酶(M5XSN6)、紫色酸性磷酸酶(M5VQF9和M5VPK4)、α-甘露糖苷酶(M5WR08)被定位在細(xì)胞壁中，其中β-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶主要參與細(xì)胞壁中糖代謝過程，可能與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中糖的合成與降解有關(guān)。而2個(gè)紫色酸性磷酸蛋白(M5VQF9和M5VPK4)具有金屬離子結(jié)合活性，主要能夠與Fe2+、Zn2+或Mn2+結(jié)合。研究表明在煙草中，NtPAP12(紫色酸性磷酸酶)對(duì)α-木糖苷酶和β-葡糖苷酶的活性起抑制作用而促進(jìn)細(xì)胞壁的合成[10-12]。因此，我們推測這些蛋白表達(dá)可能與黑李葉片細(xì)胞壁合成有關(guān)。由于細(xì)胞壁合成可能與組織抗病性有關(guān)，進(jìn)而推測免疫誘導(dǎo)劑?？奠`1號(hào)上調(diào)這些蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胞壁合成，誘導(dǎo)黑李抗病性。有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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