于寧，李影，易雪梅，丁楊峰

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050）

血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A,SAA）是一種組織淀粉樣蛋白A的前體物質，屬于急性期反應蛋白[1]。目前，在細菌、病毒感染、動脈粥樣硬化、冠心病、急性移植排斥反應、腫瘤等疾病中均檢測到血清SAA升高[2]。IL-23/Th17通路是銀屑病發(fā)病的核心機制，近期研究發(fā)現，SAA在IL-23/Th17通路的活化過程中發(fā)揮一定作用[3-4]。本研究采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）和免疫組化法檢測SAA在尋常型銀屑病皮損表達分布差異的變化。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2013年10月—2014年8月，在上海市皮膚病醫(yī)院經臨床及病理證實的尋常型銀屑病患者11例，其中男6例，女5例。采用銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）評分，總評分PASI≥10及皮損面積>10%的中、重度尋常型銀屑病患者。對照組織標本來自外科手術軀干或四肢部位的正常組織（8例）。將標本分2部分，各約50 mg組織，分別放入標記好的凍存管立即液氮速凍，-80℃冰箱保存，用于Real-time PCR檢測；另一部分用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化。

1.2 主要試劑 SAA兔抗人多克隆抗體為英國Abcam公司產品；過氧化物酶標記羊抗兔抗體、二氨基聯苯胺（DAB）酶底物顯色試劑盒為武漢博士德生物技術有限公司產品。Real-time PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 Real-time PCR法檢測SAA的表達 凍存組織研磨后用應用相關試劑提取總RNA；紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。RNA經逆轉錄生成cDNA后，進行實時熒光定量PCR檢測。引物設計合成SAA表達所需的引物序列上游為：5’-CGA AGC TTC TTT TCG TTC CTT-3’，下游為 5’-CAC CAT GGC CAA AGA ATC TC-3’；內參 GAPDH 上游5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3’;下游 5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’。選用兩管反應體系對目的基因和內參照進行擴增，建立總體積為20 μL的逆轉錄反應體系。取2 μL cDNA進行PCR擴增，擴增條件：94℃預變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火 34 s，60℃延伸 1 min，共進行 40個循環(huán)，循環(huán)結束后60℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.2 免疫組化 石蠟標本切片脫蠟水化；0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復2 min，室溫自然冷卻；3%H2O2室溫避光孵育10 min；滴加SAA一抗，4℃濕盒孵育過夜；次日，再滴加二抗，室溫孵育30 min后DAB顯色，蘇木素復染細胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。每次實驗均設立一個陰性對照，即PBS代替一抗，其余步驟相同，陰性對照DAB不能使其顯色。所有組織染色條件相同。

1.3.3 免疫組化染色結果判定 光鏡下觀察，表現為棕黃色顆粒即SAA表達陽性，著色強度高于背景非特異性染色。由2位有經驗的病理科醫(yī)生采用雙盲法觀察每張切片，隨機選取5個不重疊的高倍鏡視野（×400），按染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。按染色強度評分：無著色計0分，淡黃色（弱）計1分，淺棕色（中）計2分，深棕色（強）計3分；按陽性細胞所占比例評分：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分，2種評分相加，≤3分判為陰性（-），>3分為陽性（+）。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。對尋常型銀屑病皮損、非皮損以及正常皮膚組織SAA與GAPDH比值進行單因素方差分析，實驗結果以±s表示；采用卡方檢驗比較SAA蛋白表達陽性率。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAA mRNA表達水平 Real-time PCR實驗結果顯示尋常型銀屑病皮損組織mRNA表達強度明顯高于正常組織（7.15±2.93 vs.2.36±1.49，P<0.05）；尋常型銀屑病皮損組織表達高于皮損周圍組織（7.15±2.93 vs.3.23±2.00，P<0.05）；而皮損周圍組與正常對照組間差異無統計學意義（3.23±2.00 vs.2.36±1.49，P>0.05），見圖 1。

圖1 健康對照皮膚、尋常型銀屑病皮損及周圍正常皮膚組織中SAA mRNA表達情況比較。

2.2 免疫組化染色觀察 正常皮膚中SAA染色主要位于表皮層的基底細胞層。在尋常型銀屑病皮損中SAA染色陽性細胞彌漫分布于表皮層的棘細胞層，真皮乳頭處單個核細胞也有表達。而SAA在病變周圍組織亦表達于表皮層的基底細胞層，與正常對照組表達相近，見圖2。

2.3 SAA蛋白表達情況 SAA在尋常型銀屑病皮損組織中表達的陽性率為90.9%（10/11），高于皮損周圍組（18.2%，2/11，χ2=11.73，P<0.01）和正常對照組（12.5%，1/8，χ2=11.68，P<0.01），而正常對照組與皮損周圍組比較差異無統計學意義（χ2=0.11，P=0.73）。

3 討論

急性期反應的重要特征是急性期蛋白的誘導表達且表達水平快速升高。常見的急性期蛋白包括SAA和C反應蛋白（C-reactive protein,CRP）[1]。在血管粥樣硬化、類風濕性關節(jié)炎和炎癥性腸病等許多炎癥性疾病中，急性期蛋白已經成為一個重要的臨床標記物。同時，急性期蛋白還參與調節(jié)天然免疫和適應性免疫反應。在小鼠哮喘模型中，SAA能夠促進Th17細胞的分化維持[5]。在外周血單核細胞中，SAA還可誘導外周血單核細胞分泌IL-23[6]，而IL-23恰恰是Th17細胞分化和表型維持的關鍵細胞因子。此外，一項近期的研究顯示：SAA可以通過Notch1信號通路，促進銀屑病皮損部位真皮血管新生[7]。以上研究均提示，SAA可能在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。

圖2 SAA在健康對照皮膚、尋常型銀屑病皮損及周圍正常皮膚的免疫組化染色（免疫組化染色×200）

IL-23/Th17軸失衡是銀屑病發(fā)病機制中公認的經典理論。銀屑病的IL-23/Th17軸從概念上可分為3個階段：第一階段真皮樹突狀細胞持續(xù)表達IL-23，維持Th17細胞持續(xù)活化并釋放其特征性細胞因子IL-17和IL-22；第二階段IL-17和IL-22作用于表皮角質形成細胞，誘導角質形成細胞過度增殖、活化；第三階段活化的角質形成細胞分泌炎癥細胞因子、趨化因子及抗菌肽，吸引并作用于真皮T淋巴細胞和樹突狀細胞等，正反饋放大炎癥反應，觸發(fā)并維持銀屑病進程。

本研究通過Real-time PCR和免疫組化等方法表明，SAA在尋常型銀屑病皮損中，尤其是表皮角質形成的細胞中過度表達，與正常對照組間差異有統計學意義，提示SAA可能不僅是一種存在于循環(huán)中的急性期蛋白，而且是一種重要的局部炎癥介質。盡管以往的研究報道循環(huán)中的SAA主要來源于肝細胞，在多種組織器官中都可以檢測出SAA的表達，包括動脈粥樣硬化的斑塊區(qū)、阿爾茲海默癥患者腦組織以及類風濕性關節(jié)炎滑膜組織。筆者的觀察擴展了以往的研究，證實銀屑病患者皮損可能是另一種重要的SAA來源。銀屑病表皮角質形成細胞產生的SAA可能通過旁分泌的形式作用于真皮內的免疫活性細胞以及血管內皮細胞，導致銀屑病正反饋加重。

綜上所述，SAA在尋常型銀屑病皮損組織中表達明顯增強，提示SAA在尋常型銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。但SAA對表皮角質形成細胞以及真皮免疫活性細胞的生物學效應，仍需深入研究。

參考文獻：

[1] Ye RD,Sun L.Emerging functions of serum amyloid A in inflammation[J] .J Leukoc Biol,2015,98:923-929.

[2] Sodin-Semrl S,Zigon P,Cucnik S,et al.Serum amyloid A in autoimmune thrombosis[J] .Autoimmun Rev,2006,6:21-27.

[3] Mahil SK,Capon F,Barker JN.Update on psoriasis immunopathogenesis and targeted immunotherapy[J] .Semin Immunopathol,2016,38:11-27.

[4] Dogan S,Atakan N.Is serum amyloid A protein a better indicator of inflammation in severe psoriasis?[J] .Br J Dermatol,2010,163:895-896.

[5] Ather JL,Ckless K,Martin R,et al.Serum amyloid A activates the NLRP3 inflammasome and promotes Th17 allergic asthma in mice[J] .J Immunol,2011,187:64-73.

[6] He R,Shepard LW,Chen J,et al.Serum amyloid A is an endogenous ligand that differentially induces IL-12 and IL-23[J] .J Immunol,2006,177:4072-4079.

[7] Rooney P,Connolly M,Gao W,et al.Notch-1 mediates endothelial cell activation and invasion in psoriasis[J] .Exp Dermatol,2014,23:113-118.