丁金國 王欣 黃臻輝

摘 要 目的：采用PCR方法檢測糜蛋白酶原粗品中的豬、牛、羊源性成分。方法：利用柱式動物基因組DNA抽提試劑盒從糜蛋白酶原粗品中提取殘留DNA，以其為模板通過PCR擴增法進行動物源性成分鑒定及考察該方法的特異性及靈敏度。結(jié)果：柱提取法能夠提取適用于PCR反應(yīng)的模板DNA。PCR方法對豬、牛、羊源性成分的鑒定具有特異性，且靈敏度分別達到0.02、0.02和0.2 ng/mg。結(jié)論：建立了一種快速、有效、適用于糜蛋白酶原粗品中豬、牛、羊源DNA鑒別的方法。

關(guān)鍵詞 糜蛋白酶原粗品 PCR 種屬鑒定

中圖分類號：TQ464.53 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）07-0077-04

Identification of porcine， bovine and sheep derived-components in crude chymotrypsinogen by PCR

DING Jinguo*， WANG Xin， HUANG Zhenhui

（SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To determine the porcine， bovine and sheep derived components in crude chymotrypsinogen by PCR. Methods： The residual DNA was extracted from crude chymotrypsinogen by Ezup genomic DNA extraction kit and used as template for the PCR to identify the animal origin. The specificity and sensitivity of the established method were verified and the contents of animal derived components in crude chymotrypsinogen could be determined by PCR. Results： DNA template for PCR could be extracted by the kit. The PCR assay was proved to be specific and sensitive with the detection limit as low as 0.02， 0.02， 0.2 ng/mg for porcine， bovine and sheep derived components， respectively. Conclusion： A rapid and effective method is established for the identification of porcine， bovine and sheep derived components in crude chymotrypsinogen.

KEy WORDS chymotrypsinogen； PCR； species identification

動物來源的生化原料粗品通常會殘留物種DNA信息，利用殘留DNA作為模板通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法進行種屬鑒定具有快速、靈敏、特異性強的特點，在肝素粗品的質(zhì)量控制中得到深入研究[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，肝素粗品中DNA殘留量較低，檢測靈敏度需達到0.1～0.3 ng/mg（每1 mg肝素粗品中含0.1～0.3 ng DNA）[2-3]。研究還發(fā)現(xiàn)肝素對DNA有較強的吸附作用，干擾殘留DNA的提取。肝素粗品殘留DNA提取液中還可能含有抑制PCR反應(yīng)的成分。這些研究發(fā)展成為Biogx實時熒光PCR試劑盒，它能夠高靈敏度定量檢測肝素粗品中反芻動物（不能區(qū)分牛、羊）與豬源性成分，在工業(yè)界得到廣泛應(yīng)用[5]。

2017年國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范生化藥品附錄》，要求生化藥品的原材料來源應(yīng)相對穩(wěn)定，應(yīng)明確動物的種屬及器官組織，必要時對原材料的動物種屬進行鑒別。糜蛋白酶為生化藥品，系從牛胰中提取的一種蛋白水解酶，可以分解炎癥部位纖維蛋白的凝結(jié)物，促進血凝塊、膿性分泌物及壞死組織的溶化分解，從而凈化創(chuàng)面、使肉芽組織新生，促進傷口愈合；也可霧化吸入用于化痰。糜蛋白酶由糜蛋白酶原粗品經(jīng)胰蛋白酶激活后，經(jīng)多次鹽析、結(jié)晶得到。糜蛋白酶原粗品由新鮮胰臟經(jīng)絞碎、提取、反復(fù)硫酸銨鹽析得到，新鮮胰臟富含DNA酶。考慮到從豬、羊胰臟中也能提取純化得到糜蛋白酶原粗品，為從源頭上控制產(chǎn)品質(zhì)量，對糜蛋白酶原粗品中殘留DNA進行提取，設(shè)計豬、牛、羊源性特異引物進PCR檢測，建立了一種鑒別糜蛋白酶原粗品種屬來源的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

糜蛋白酶原粗品源自我公司；豬、牛、羊源性胰臟基因組DNA （103 ng/ml）購自Zyagen公司；BioGX反芻源和豬源DNA檢測試劑（Promega公司，批號：218-16-002A）；RT-PCR 級純化水（Ambion by life technologies，批號：1512065）； 2×Premix Taq （Takara Ex Taq 含1.25 U/25 ml，dNTP混合物各0.4 mmol/L，Ex Taq緩沖液4 mmol/L，Mg2+，Takara公司，批號：A9601A）；Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（批號：C107KA1949）、瓊脂糖H （批號：BA23BA0002）、4s green plus 核酸染色液（批號：CA11BA0012）、6×上樣緩沖液（批號：BC02KA1558）、DNA分子量標準C（批號：BA09KA1263）均購自上海生工生物公司。引物由上海生工生物公司合成；無水乙醇（分析純，上海振興化工一廠，批號：201605301）。

1.2 儀器

7500-Fast實時熒光PCR儀（美國Applied Biosystems Ltd.）；Gusto微量離心機和LP渦旋振蕩器（美國Thermo Ltd.）；HH-W600數(shù)顯恒溫三用水箱（上海喬躍公司）；電子天平（上海精科公司）；電泳儀（美國BioRad公司）；藍光切膠儀（上海生工生物公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 糜蛋白酶原粗品中殘留DNA的提取

稱取約250 mg糜蛋白酶原粗品，利用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒進行DNA的提取，以50 ml CE Buffer洗脫，所得DNA溶液于-20 ℃保存或進行PCR檢測。

1.3.2 實時熒光PCR

以Biogx反芻源和豬源DNA檢測試劑為基礎(chǔ)構(gòu)建糜蛋白酶原粗品的實時熒光PCR檢測體系：每管實時熒光PCR檢測粉末用100 ml純水溶解成反應(yīng)預(yù)混液。反應(yīng)預(yù)混液25 ml，模板DNA 1 ml。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性120 s，然后，95 ℃ 10 s，56 ℃ 60 s，45個循環(huán)，每個循環(huán)的退火過程采集熒光。每次實驗設(shè)陽性和陰性反應(yīng)對照。陽性對照以標準DNA（10 ng/ml）為模板DNA，陰性對照以純水代替模板DNA。以牛胰標準DNA梯度稀釋液獲得的Ct值對DNA濃度的對數(shù)作圖得標準曲線，將檢測Ct值代入標準曲線即可算出DNA濃度。

1.3.3 PCR

PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建：模板溶液1 ml，上游引物（10 pmol/ml）1 ml，下游引物（10 pmol/ml）1 ml，2×Premix Taq 12.5 ml，加純化水至25 ml。反應(yīng)條件為94 ℃變性3 min，然后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min；反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃保溫。取24 ml PCR擴增產(chǎn)物加入4 ml上樣緩沖液（含0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯苯胺、60%甘油）混合后上樣。1%（w/v）瓊脂糖凝膠，電壓120 V電泳40 min，在藍光切膠儀下進行觀察。通過與DNA分子量標準比較，判斷PCR產(chǎn)物特異性條帶的相對分子質(zhì)量大小，從而對樣品是否含有豬牛羊源性成分進行判定。

1.3.4 凝膠電泳圖像

采用4s green plus 核酸染色液在藍光儀上用普通相機拍照。

2 結(jié)果

2.1 糜蛋白酶原粗品中殘留DNA的提取

糜蛋白酶原粗品中殘留DNA是PCR的模板DNA來源，要求能夠有效提取，且提取液中不能含有Taq酶抑制劑等影響PCR反應(yīng)的成分。糜蛋白酶原粗品由新鮮胰臟經(jīng)過多步純化得到，加之胰臟中富含DNA酶，故DNA因分離去除和酶降解而殘留量極低。糜蛋白酶原等大分子蛋白也會對殘留DNA提取造成干擾。使用Biogx實時熒光PCR對牛胰標準DNA進行檢測，其線性范圍、檢測限、檢測回收率均經(jīng)過驗證。糜蛋白酶原粗品中加入牛胰標準DNA，用不同方法提取混合物中的DNA，經(jīng)Biogx實時熒光PCR對提取液進行DNA定量檢測，評估提取回收率。實驗發(fā)現(xiàn)用1.3.1所述柱提取法可從糜蛋白酶原粗品中有效提取殘留DNA，提取回收率可穩(wěn)定在1%左右。

2.2 引物設(shè)計

Biogx實時熒光PCR具有較高的靈敏度與定量檢測能力，但不能區(qū)分牛、羊源性DNA。選擇線粒體基因組的特征性序列：豬細胞色素氧化酶亞基I（COX I）基因EU623453.1、牛COX I基因DQ487094.1、羊COX I基因EU834864.1，使用Primer Premier軟件設(shè)計引物[5]。豬源性成分鑒別引物（5′至3′）：上游GGCACCCTGTACCTACTATTTGG，下游ATTCCGAATCCTGGTAAGATGAG，產(chǎn)物長度713 bp。牛源性成分鑒別引物（5′至3′）：上游GAGAGTAGTAGTAGTACGGCGGTAAT，下游CATCCTCTATAGTTGAAGCTGGG，產(chǎn)物長度253 bp。羊源性成分鑒別引物（5′至3′）：上游TAGATCTAACTATTTTCTCCCTACATCTG，下游GGTGTTGGTATAGGATAGGGTCTC，產(chǎn)物長度273 bp。

2.3 方法特異性驗證

按照1.3.3所述配制PCR體系進行豬、牛、羊源性成分檢測，瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示。豬、牛、羊胰標準DNA及其混合物分別在相應(yīng)的動物源性成分檢測引物引導(dǎo)下進行PCR擴增，得到清晰且單一的條帶。通過與DNA分子量標準比較，條帶大小符合預(yù)期。產(chǎn)物條帶經(jīng)測序證明其核酸序列分別和豬COX I基因EU623453.1、牛COX I基因DQ487094.1、羊COX I基因EU834864.1相符。結(jié)果顯示，所設(shè)計豬、牛、羊特異性引物分別僅可擴增出相應(yīng)的動物源性成分（圖1），說明本研究建立的PCR檢測方法對豬、牛、羊源性成分檢測具有高度特異性。

2.4 方法檢測限驗證

分別將1 ng/ml的豬、牛、羊胰標準DNA用水進行10倍梯度稀釋，取各濃度的稀釋液1 ml進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示。隨著模板量的減少，PCR產(chǎn)物條帶亮度逐漸遞減。以產(chǎn)生可清晰判斷條帶的最低模板量為本方法的檢測限，可知豬、牛、羊胰標準DNA檢測限分別為1 pg、1 pg和10 pg（圖2）。250 mg糜蛋白酶原粗品經(jīng)柱提取法抽提可得到50 ml提取液，如果提取液中牛殘留DNA濃度達到1 pg/ml即可被檢出。按照1%的提取回收率計算，即使250 mg糜蛋白酶原粗品中僅含有低至5 ng殘留牛DNA也可被檢出，檢出限度為0.02 ng/mg。因而柱法提取聯(lián)合PCR對糜蛋白酶原粗品中的豬、牛、羊源性成分能夠特異性檢出，檢測限度可分別達到0.02、0.02和0.2 ng/mg。

2.5 糜蛋白酶原粗品中動物源性成分的PCR檢測

結(jié)果如圖3所示，糜蛋白酶原粗品1和2的DNA提取液中均檢出牛源性成分且均未檢出豬、羊源性成分；糜蛋白酶原粗品3的DNA提取液中豬、牛、羊源性成分均顯示陰性。經(jīng)Biogx實時熒光PCR檢測該批次糜蛋白酶原中反芻DNA殘留量為0.004 ng/mg，低于本文建立PCR的檢測限，因此未檢出。

3 討論

糜蛋白酶原粗品種屬來源的鑒別能夠從源頭上控制生化藥品糜蛋白酶的質(zhì)量、符合最新法規(guī)要求。

用Biogx實時熒光PCR可以用于評估殘留DNA提取效率。本文參照文獻磁珠法未能從糜蛋白酶原中有效提取DNA，而柱式提取法取得較好的效果。Ezup柱式動物基因組抽提試劑盒中含有蛋白酶K，可將與DNA結(jié)合的糜蛋白酶原等蛋白質(zhì)降解，再通過吸附柱分離出DNA，分離液中不含有PCR反應(yīng)抑制成分，從而獲得可用于下一步PCR檢測的DNA模板。

與肝素粗品類似，糜蛋白酶原粗品經(jīng)過反復(fù)分離純化，加上有DNA酶的降解作用，殘留DNA含量極低，提取回收率也很低。因此選定合適的檢測方法成為鑒別糜蛋白酶原粗品中動物源性成分的難點，特別是在保證鑒定結(jié)果特異性高的條件下還需盡量保證靈敏度。細胞色素氧化酶亞基I基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定以及不與組蛋白結(jié)合因而裸露，并且拷貝數(shù)多。本文針對該基因設(shè)計并篩選出了特定引物對來區(qū)分偶蹄目中不同物種，通過優(yōu)化選擇了Takara Taq酶反應(yīng)系統(tǒng)與PCR參數(shù)，PCR反應(yīng)靈敏度達到pg級，符合糜蛋白酶原粗品中動物源性成分鑒定要求。

綜上所述，本文建立了一種快速有效的、能夠區(qū)分豬、牛、羊來源的糜蛋白酶原粗品的種屬鑒定方法。研究結(jié)果能夠明確糜蛋白酶原的種屬來源，為生化藥品糜蛋白酶的規(guī)范化生產(chǎn)提供了技術(shù)保證。為了能夠檢測殘留DNA低于0.02 ng/mg的樣品、定量檢測糜蛋白酶原粗品中的異物種污染、提高檢測效率，我們將優(yōu)化殘留DNA的提取方法以提高提取回收率，設(shè)計熒光探針提高PCR檢測的靈敏度，調(diào)整引物使得豬、牛、羊源性PCR產(chǎn)物分子量差異明顯且能夠在同一反應(yīng)體系中實現(xiàn)特異性反應(yīng)，以實現(xiàn)多重PCR反應(yīng)同時鑒定三個物種。

致謝：感謝汪雅雯、劉弘忍對本文的貢獻。

參考文獻

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