趙福成，韓艷茹，賈 奎，劉彩莉，劉振洲

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因。每年約有1 800萬人被診斷患有肺癌，約有1 600人死于該疾病[1]。根據(jù)其癌癥分級(jí)和發(fā)病地區(qū)的不同，肺癌總體的5年生存率約為4%～17%[2]。肺癌的治療方式主要包括手術(shù)、放療、化療、經(jīng)皮消融和姑息治療等[3]。它是一類異質(zhì)性極高的惡性腫瘤[4]，根據(jù)其組織病理學(xué)的差異，目前肺癌的分類分型已超過50種[5]。由于不同類型的肺癌具有不同的遺傳，生物和臨床特征，對(duì)不同治療的反應(yīng)性也不盡相同，所以對(duì)肺癌的分類治療是很有必要的，以確保肺癌患者獲得最佳的治療方式[6]。

近年來，為了治療晚期肺癌，學(xué)者們已經(jīng)研發(fā)了多種分子靶向療法。例如吉非替尼（Iressa），其靶點(diǎn)為表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，它在許多非小細(xì)胞肺癌中都有表達(dá)[7]。埃羅替尼（Tarceva）是另一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑，2004年被美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于晚期非小細(xì)胞肺癌的二線治療，與吉非替尼類似，它似乎在女性、亞洲人、非吸煙者和支氣管肺泡癌患者中效果更好，特別是對(duì)于EGFR有特異突變的患者[8]。

厄洛替尼也是一種用于治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的靶向藥物。它是作用于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的酪氨酸激酶抑制劑。FDA批準(zhǔn)厄洛替尼用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。無論肺癌患者是否有EGFR突變，厄洛替尼均能改善其生存時(shí)間，但在EGFR突變患者中效果更好，無進(jìn)展生存期和5年生存率與標(biāo)準(zhǔn)二線治療（多西他賽或培美曲塞）相似，總體反應(yīng)率較標(biāo)準(zhǔn)二線化療提高了約50%[9]。與其他ATP競(jìng)爭(zhēng)性小分子酪氨酸激酶抑制劑（如CML中的伊馬替尼）一樣，使用厄洛替尼的患者在治療開始8～12個(gè)月內(nèi)會(huì)迅速發(fā)展抗藥性。超過50%的抗藥性是由EGFR激酶區(qū)域的ATP結(jié)合區(qū)的突變引起的，主要是由于非極性甲硫氨酸殘基（T790M）取代極性蘇氨酸殘基所致。雖然“守門人”突變假說的支持者表明這種突變阻止厄洛替尼通過空間位阻的結(jié)合，但研究表明T790M賦予ATP結(jié)合親和力的增加，從而降低厄洛替尼的抑制功效[10-11]。

青蒿素是從黃花蒿中提取出來的一種晶狀體，青蒿素及其半合成衍生物是治療瘧疾的首選藥物[12]。青蒿素及其衍生物已被證明具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，它能參與細(xì)胞一系列的生理生化過程，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和抗血管生成作用[13]。

本研究使用A549細(xì)胞株進(jìn)行青蒿素和厄洛替尼聯(lián)合應(yīng)用，通過檢測(cè)A549細(xì)胞活力和凋亡情況，以及藥物對(duì)小鼠成瘤的影響，探究蒿素聯(lián)合厄洛替尼對(duì)NSCLC的治療的潛在可能。

1 方法

1.1 細(xì)胞系和試劑 人肺癌細(xì)胞株A549由上海細(xì)胞生物研究所提供。RPMI-1640培養(yǎng)液、10%新生小牛血清、含100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的0．25%胰酶溶液購(gòu)自Gibco公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞在含有10%FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中，37℃環(huán)境下在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%左右濃度時(shí)進(jìn)行傳代和凍存，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔板購(gòu)自杭州四季慶生物工程材料有限公司。

1.2 藥物和試劑 青蒿素購(gòu)自Sigma公司。厄洛替尼購(gòu)自羅氏公司。將厄洛替尼溶解于DMSO，配置為終濃度為 2．5×104μmol/L 的溶液，分裝保存于-20 ℃冰箱備用，加藥時(shí)用PBS溶液（pH7．2）稀釋至目標(biāo)濃度。CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁研究所。Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海美季生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞活性的測(cè)定 使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的活性。將A549細(xì)胞接種在96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。更換新培養(yǎng)基，將樣品置入處理組和對(duì)照組中。處理組中的細(xì)胞用 0．5、1、2．5、5、10 或 20 μg/mL 青蒿素和/或厄洛替尼處理24 h。處理后，將96孔板中的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基替換。然后加入20μL的CCK-8溶液，并在37℃下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀板在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量不同組的OD值。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞術(shù)FITC-Annexin V/PI雙染色被認(rèn)為是理想的定量測(cè)定細(xì)胞凋亡的方法。將A549細(xì)胞以2×106的密度接種在6孔板中細(xì)胞/孔并生長(zhǎng)24h。然后單獨(dú)用青蒿素處理（10μg/mL），單獨(dú)用厄洛替尼（10μg/mL）或青蒿素（10μg/mL）+厄洛替尼（10μg/mL）處理24h。加入100μL細(xì)胞懸液5μL Annexin V-FITC和10μLPI，并將細(xì)胞在黑暗中孵育30 min。PI（5μL，濃度為10μg/mL）加入細(xì)胞，在黑暗中再次孵育10 min。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞以識(shí)別細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞增殖指數(shù)按照下列公式計(jì)算：PI%=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.5 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 通過A549細(xì)胞建立小鼠成瘤模型來研究青蒿素和厄洛替尼在體內(nèi)是否有抑癌的作用?？偣策x取了35只雄性BALB/c裸鼠（年齡6～8周；體質(zhì)量約等于25 g），小鼠喂養(yǎng)在25℃和70%相對(duì)濕度的環(huán)境下，同時(shí)給予12 h光照/黑暗循環(huán)。所有小鼠的飲水及飼料都經(jīng)過高溫高壓處理。首先建立小鼠成瘤模型。將含有2×106A549細(xì)胞的100μL PBS溶液皮下注射到每只老鼠的背部，每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤的體積，測(cè)量公式如下：腫瘤體積=0．5×長(zhǎng)軸×短軸2。同時(shí)每?jī)商鞙y(cè)量1次小鼠的質(zhì)量。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100 mm3時(shí)，將小鼠分為5組（每組7只）進(jìn)行不同處理，分組如下：1）對(duì)照組（無注射）。2）生理鹽水組，每只小鼠用100μL的生理鹽水進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。3）青蒿素組，每只小鼠接受15 mg/kg青蒿素的腫瘤內(nèi)注射。4）厄洛替尼組，每只小鼠接受15 mg/kg厄洛替尼的腫瘤內(nèi)注射。5）聯(lián)合治療組，每只小鼠接受15 mg/kg青蒿素+15 mg/kg厄洛替尼的腫瘤內(nèi)注射。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，重復(fù)測(cè)量資料采取重復(fù)測(cè)量方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞活性的影響 CCK-8是常用的檢測(cè)細(xì)胞活力的方法。如表1所示，隨著青蒿素和厄洛替尼濃度的升高，A549的細(xì)胞活性隨之下降。用不同濃度的青蒿素（DHA）單獨(dú)處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活性在45%～95%之間；用不同濃度的厄洛替尼（DOX）單獨(dú)處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活性在42%～94%之間。使用青蒿素和厄洛替尼聯(lián)合治療后，細(xì)胞活力降低達(dá)到91%。當(dāng)10μg/mL青蒿素和10μg/mL厄洛替尼的組合處理細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞活力下降了89%，與5μg/mL青蒿素+5μg/mL 厄洛替尼的組合有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），而20μg/mL青蒿素+20μg/mL厄洛替尼的組合無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。因此，將 10μg/mL 青蒿素加10μg/mL厄洛替尼作為最佳的濃度。

2.2 驗(yàn)證青蒿素和厄洛替尼誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步驗(yàn)證青蒿素和厄洛替尼所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式是凋亡，選擇使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法。如圖1所示，各組的凋亡率分別為 3．1%±1．9%、50．2%±4．6%、41．2%±3．5%、28．7%±5．5%、90．2%±2．5%。在用青蒿素+厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞處理后，凋亡細(xì)胞的百分比從3%（對(duì)照）增加到90%（24 h），但壞死細(xì)胞的增加并不明顯。陽性對(duì)照組（STS）顯示Q2+Q4代表了細(xì)胞凋亡。在使用青蒿素或厄洛替尼單獨(dú)處理的細(xì)胞中，也存在細(xì)胞凋亡，但聯(lián)合用藥組的凋亡率高于單獨(dú)用藥組（P＜0．01）。

2.3 青蒿素和厄洛替尼對(duì)小鼠成瘤的影響 本研究對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤注射不同的藥物，通過評(píng)估腫瘤體積的改變來評(píng)估藥物對(duì)腫瘤的治療效果。在接種細(xì)胞4～7 d后，腫瘤開始形成，所有小鼠均成功成瘤。腫瘤形成的早期小鼠一般情況無明顯差異，體質(zhì)量、精神、攝食等未將顯著變化。隨著腫瘤的增大，小鼠的精神和活動(dòng)逐漸變差，各組間無明顯的差異，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠無死亡。聯(lián)合治療組在使用青蒿素+厄洛替尼處理小鼠后各時(shí)點(diǎn)均對(duì)腫瘤有顯著的抑制增長(zhǎng)作用，與對(duì)照組和生理鹽水組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見表 2。

2.4 青蒿素和厄洛替尼對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 藥物的體內(nèi)毒性一直是臨床關(guān)注的問題。通過監(jiān)測(cè)給藥后小鼠體質(zhì)量的變化來判斷藥物的毒性作用。如表3所示，與對(duì)照組相比，小鼠的體質(zhì)量均緩慢上升，無論是單獨(dú)用藥還是聯(lián)合用藥，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果說明藥物對(duì)小鼠無明顯毒性作用。

3 討論

圖1 青蒿素和厄洛替尼對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。Fig.1 Effectsof artemisinin and erlotinib on cell apoptosis.

表1 .不同濃度的青蒿素和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞活性的影響（x±s）Tab.1 Effect on the viability of the A549 cellsafter 24 h of treatment with Artemisinin and Erlotinib at different concentrations（x±s）

表2 青蒿素和厄洛替尼聯(lián)合用藥對(duì)小鼠成瘤的影響（x±s）Tab.2 Effect of artemisinin and erlotinib on tumorigenesis in mice（x±s）

表3 青蒿素和厄洛替尼聯(lián)合用藥對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（x±s）Tab.3 Effect of artemisinin and erlotinib on body weight in mice（x±s）

青蒿素及其衍生物，作為一種從中草藥中提取的物質(zhì)，在具有強(qiáng)大抗瘧功效的同時(shí)也被證實(shí)有一定的改善免疫系統(tǒng)的作用和抗腫瘤作用[14-16]。抗腫瘤作用包括增強(qiáng)藥物的選擇性，扭轉(zhuǎn)多重耐藥性，對(duì)放化療的增敏作用等。許多的青蒿素衍生物都被合成用來治療多種腫瘤，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌、肝細(xì)胞肝癌、胰腺癌、腎癌、骨肉瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤和白血病。這些衍生物的作用在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到了相應(yīng)證實(shí)[17]。Park等發(fā)現(xiàn)青蒿素對(duì)乳腺癌細(xì)胞有一定細(xì)胞毒性作用，但卻不殺傷正常的乳腺細(xì)胞[18]。最初的研究者認(rèn)為青蒿素產(chǎn)生抗腫瘤作用主要是因?yàn)楫a(chǎn)生了活性氧類（ROS）。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)還存在著其他與活性氧類無直接聯(lián)系的抗腫瘤機(jī)制，例如它能誘導(dǎo)凋亡與自噬，使細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞增殖的減少，改變的腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，抑制腫瘤血管生成等[13]。

酪氨酸激酶受體（RTKs）在肺癌中起到關(guān)鍵的作用。通過使用小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）吉非替尼和厄洛替尼，治療晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。厄洛替尼特異性針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶，這種酶在多種腫瘤及其突變體中高度表達(dá)。它可以以可逆的方式與磷酸三腺苷（ATP）的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。對(duì)于信號(hào)的傳導(dǎo)，需要由兩個(gè)EGFR分子聚集在一起形成同型二聚體，然后使ATP分子在產(chǎn)生的磷酸酪氨酸殘基上發(fā)生互相磷酸化，將磷酸酪氨酸結(jié)合蛋白募集到EGFR上，組裝后將信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞到到細(xì)胞核上或激活其他細(xì)胞生化過程。當(dāng)厄洛替尼與EGFR結(jié)合時(shí)，EGFR與磷酸酪氨酸殘基的形成被阻斷，從而不啟動(dòng)級(jí)聯(lián)信號(hào)的傳遞[19]。

對(duì)于EGFR激酶結(jié)構(gòu)域突變（通常為L(zhǎng)858R）和外顯子19缺失的患者，他們對(duì)吉非替尼/厄洛替尼的反應(yīng)性較好。盡管一項(xiàng)大型的Ⅲ期的臨床試驗(yàn)（NCIC-BR．21）證實(shí)[20]，厄洛替尼可以延長(zhǎng)肺癌患者的生存期，但大多數(shù)未經(jīng)過基因篩選的肺癌患者仍然對(duì)厄洛替尼敏感性較差?；蛐蜑橐吧虴GFR的肺癌患者往往從一開始就對(duì)厄洛替尼無反應(yīng)，突變型EGFR的初始應(yīng)答者也有可能發(fā)展為二次藥物抵抗。所以對(duì)于厄洛替尼無效或效果不佳的肺癌患者，需要尋找一種新的途徑來解決問題[9]。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，首先通過使用不同濃度的青蒿素和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞的作用，來篩選抑制該細(xì)胞活性的最佳濃度組合，最終發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用青蒿素和厄洛替尼，比單獨(dú)使用這兩種之一能更有效抑制細(xì)胞的活性，對(duì)細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。凋亡在腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展具有重要的生物學(xué)意義。眾多化療藥物通過誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞凋亡以達(dá)到抗腫瘤作用。既往的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。本實(shí)驗(yàn)的第2個(gè)實(shí)驗(yàn)探究青蒿素和厄洛替尼是否能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中使用流式細(xì)胞術(shù)來確定細(xì)胞死亡的模式。最終結(jié)果表明，在青蒿素+厄洛替尼處理后，A549細(xì)胞的凋亡率達(dá)到90%。這證明了青蒿素和厄洛替尼能協(xié)同促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，研究了青蒿素和厄洛替尼對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤的治療效果。腫瘤內(nèi)注射越來越多地被應(yīng)用于治療腫瘤[22]。在本研究中，筆者使用腫瘤內(nèi)注射治療荷瘤小鼠，并觀察到青蒿素和厄洛替尼聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤的抑制作用顯著。

綜上所述，青蒿素和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞的抑制上表現(xiàn)出協(xié)同性。同時(shí)青蒿素和厄洛替尼通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來達(dá)到對(duì)腫瘤的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合使用青蒿素和厄洛替尼對(duì)腫瘤的抑制有顯著的效果。這項(xiàng)研究的結(jié)果對(duì)肺癌的治療方案提供了一種新的思路。

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