夏 靜 夏蒙蒙 牛長(zhǎng)敏 申雪沂 王建軍 鄭 英

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（江蘇揚(yáng)州 225001）

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約18-22nt的小分子非編碼RNA，它們能結(jié)合在多個(gè)下游靶基因的3′UTR（3’端非編碼區(qū)），通常導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，進(jìn)而在一系列生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要功能[1]。研究表明miRNA也參與精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控，且有表達(dá)細(xì)胞特異性及階段性[2]。一些特異性的miRNA能作為診斷男性不育的潛在標(biāo)記[3,4]。Stra8（stimulated by retinoic acid 8）對(duì)精子發(fā)生具有重要意義，其對(duì)減數(shù)分裂的啟動(dòng)是必須的，同時(shí)它對(duì)精原細(xì)胞的分化也發(fā)揮著重要的作用，但是其調(diào)控精子發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。miRNA是否能通過(guò)Stra8調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程尚不清楚。利用生物信息學(xué)分析方法，我們發(fā)現(xiàn)Stra8是miR-194-5p下游靶基因之一，因此我們?cè)噲D探討miR-194-5p與Stra8之間是否具有調(diào)控關(guān)系。本研究旨在構(gòu)建攜帶miR-194-5p的慢病毒表達(dá)載體，并包裝成慢病毒，以期達(dá)到高效穩(wěn)定感染目的細(xì)胞Stra8-GC1-spg，建立穩(wěn)定表達(dá)miR-194-5p的精原細(xì)胞株，為深入研究miR-194-5p與Stra8之間的調(diào)控關(guān)系及闡明Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制提供參考價(jià)值。

材料和方法

一、材料

慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pMSCV-PIG及Gag pol、VSV.G輔助質(zhì)粒由江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郁多男教授惠贈(zèng)。LA tag酶、EcoRⅠ BglⅡ、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。pGEM-T-easy 載體、T4 DNA連接酶、切膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司。293T細(xì)胞、Stra8-GC1-spg、大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室前期保存。DMEM、FBS購(gòu)自Hyclone公司；X-gal和IPTG、嘌呤霉素、PEI購(gòu)自北京索萊寶生物有限公司；核酸提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；引物合成及DNA測(cè)序由深圳華大基因生物工程公司完成。

二、方法

（一）目的片段的擴(kuò)增

利用小鼠基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增引物：F：5′-GGAGATCTCCACCA CACACCAGGAAGAG-3′，R: 5′-GGGAATTCT AACCAAGAGCCCACCCAG-3′；PCR反應(yīng)體系：ddH2O 31.5μL，LA buffer 5μL，2.5mMdNTPs 8μL，F(xiàn)(10μM)2μL，R（10μM）2μL，LA tag酶0.5μL，DNA 1μL；PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

（二）pGEM-T-easy-miR194-5p重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，后與pGEM-T-easy 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)中，涂于LB瓊脂糖平板（含50μg /μL X-gal和0.1moL IPTG、50μg /mL氨芐青霉素）上。37℃孵育過(guò)夜，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，取白色克隆,搖菌過(guò)夜，堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定，最后進(jìn)行DNA序列測(cè)定驗(yàn)證。

（三）pMSCV-PIG-miR194-5p重組載體構(gòu)建

將pGEM-T-easy-miR194-5p及慢病毒載體pMSCV-PIG分別進(jìn)行EcoRⅠ、BglⅡ雙酶切，回收并純化所需片段，以載體插入片段=1:3～1:5摩爾比進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌后涂于LB瓊脂糖平板（含50μg /mL氨芐青霉素）上，37℃過(guò)夜。次日，挑單菌落接種于LB培養(yǎng)液（50μg /mL氨芐青霉素）中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜,用堿裂解法提取質(zhì)粒，利用EcoRⅠ、BglⅡ雙酶切鑒定。

（四）慢病毒包裝

將293T細(xì)胞鋪于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，使次日細(xì)胞融合率為60%左右。每孔加3mL DMEM完全培養(yǎng)基。慢病毒包裝轉(zhuǎn)染體系：0.9%NaCl 500μL、Gag pol 3μg 、VSV.G 3μg、pMSCV-PIG-miR194-5p 8μg（實(shí)驗(yàn)組）或pMSCV-PIG 8μg（對(duì)照組）、PEI 100μL（μg/μL），混勻后室溫孵育10min，加至培養(yǎng)的293T細(xì)胞中，37℃、5%CO2過(guò)夜，12h后更換為DMEM完全培養(yǎng)基。分別收集轉(zhuǎn)染后36h、48h、60h、72h的病毒上清，經(jīng)0.45μm濾器過(guò)濾，-80℃保存。

（五）慢病毒感染效果的驗(yàn)證

將293T細(xì)胞鋪于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，使次日細(xì)胞融合率為60%左右。按照以下體系感染293T細(xì)胞：慢病毒上清 2mL、enhance 液1mL、polybrene 1.5μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6h后進(jìn)行重復(fù)感染一次。6h后再進(jìn)行第三次感染。6h后更換為新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。72h后用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察感染的293T細(xì)胞有無(wú)綠色熒光。分別提取pMSCV-PIG-miR194-5p感染組及 pMSCV-PIG對(duì)照組293T細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRTPCR驗(yàn)證感染慢病毒的293T細(xì)胞內(nèi)的miR194-5p轉(zhuǎn)錄水平。

（六）穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR194-5p Stra8-GC1-spg細(xì)胞株的建立

將Stra8-GC1-spg細(xì)胞鋪于六孔板內(nèi)，使次日細(xì)胞融合率為50%左右。在六孔板每孔內(nèi)加入enhance液0.5mL、慢病毒上清1.5mL 、polybrene1μL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6h后進(jìn)行重復(fù)感染一次。6h后再進(jìn)行第三次感染。6h后更換為新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。72h后用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞是否帶有綠色熒光。用5μg/mL嘌呤霉素篩選一周，以獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR194-5p Stra8-GC1-spg細(xì)胞株。

（七）miR194-5p表達(dá)水平的驗(yàn)證

分別取感染慢病毒pMSCV-PIG-miR194-5p及對(duì)照組pMSCV-PIG的Stra8GC1細(xì)胞，用TRIzol提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以此cDNA為模板，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miR194-5p的表達(dá)水平，并用2-ΔΔct計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、目的基因片段pri-miR194-5p的擴(kuò)增

以小鼠基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，獲得目的基因片段pri-miR194-5p，其大小為293bp，與預(yù)計(jì)片段大小相一致（圖1）。

圖1 pri-miR194-5p PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

二、pri-miR194-5p與pGEM-T-easy 載體的連接

將pri-miR194-5p PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體相連接，經(jīng)酶切鑒定證實(shí)PCR片段已成功插入到pGEMT-easy載體（圖2）。DNA序列測(cè)定證實(shí)此序列與pri-miR194-5p序列完全一致。表明pGEM-T-easy-primiR194-5p重組載體構(gòu)建成功。

三、pMSCV-PIG-miR194-5p重組載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pGEM-T-easy-pri-miR194-5p及空載慢病毒載體pMSCV-PIG分別進(jìn)行雙酶切,然后進(jìn)行連接，獲得的重組質(zhì)粒pMSCV-PIG-miR194-5p經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pMSCV-PIG-miR194-5p構(gòu)建成功（圖3）。

四、慢病毒的包裝及表達(dá)的驗(yàn)證

圖2 pGEM-T-easy-pri-miR194-5p酶切鑒定產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 pMSCV-PIG-miR194-5p酶切鑒定

圖4 pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72h后熒光圖

圖5 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染293T細(xì)胞72h后熒光圖

應(yīng)用PEI法轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，72h后熒光顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)293T細(xì)胞均顯示綠色熒光（圖4）。用慢病毒上清感染293T細(xì)胞，72h后熒光顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)大部分293T細(xì)胞顯示綠色熒光（圖5）。表明包裝的慢病毒顆粒能成功感染細(xì)胞。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)感染后的293T細(xì)胞進(jìn)行miR194-5p表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)高水平miR194-5p（圖6）。提示慢病毒能有效感染293T細(xì)胞并高表達(dá)miR194-5p。

五、過(guò)表達(dá)miR194-5p Stra8-GC1-spg細(xì)胞株的建立

應(yīng)用慢病毒上清感染Stra8-GC1-spg。72h后熒光顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有綠色熒光產(chǎn)生（圖7）。經(jīng)嘌呤霉素篩選1周后，對(duì)miR194-5p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組Stra8-GC1-spg細(xì)胞中miR194-5p的表達(dá)量明顯增高（圖8），表明成功穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR194-5p Stra8-GC1-spg細(xì)胞株。

圖6 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染的293T細(xì)胞中miR194-5p相對(duì)表達(dá)水平分析

圖7 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染Stra8-GC1-spg細(xì)胞72h后熒光圖

圖8 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染的Stra8-GC1-spg細(xì)胞中miR194-5p的相對(duì)表達(dá)水平分析

討 論

精子發(fā)生是高度精密的過(guò)程，此期間需要大量的基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀(guān)遺傳學(xué)水平對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。大量研究發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生的不同階段，miRNAs作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，可能通過(guò)激活特異性基因的表達(dá)參與精子發(fā)生[5]。在人類(lèi)精子發(fā)生中，miRNAs也發(fā)揮著重要的功能[6,7]。 研究發(fā)現(xiàn)在小鼠精子發(fā)生中一些miRNAs（miR-221, miR-203, miR-34b-5p）特異性表達(dá)于精原干細(xì)胞、減數(shù)分裂前細(xì)胞及減數(shù)分裂細(xì)胞中[8]。 miR-34c特異性表達(dá)在睪丸內(nèi)，且主要表達(dá)在減數(shù)分裂晚期的粗線(xiàn)期精母細(xì)胞及精子細(xì)胞中[9]。 miR-449a 及miR-34b/c在鼠科精子發(fā)生中有協(xié)同作用[10]。miR-146能作用在靶基因Med1上進(jìn)而阻礙視磺酸誘導(dǎo)精原細(xì)胞分化[11]。 另外，miR-221/222家族通過(guò)作用在Kit mRNA 上，進(jìn)而維持未分化精原細(xì)胞數(shù)量[12]。

目前已知Stra8作為精子發(fā)生中一個(gè)基因，對(duì)精原細(xì)胞的分裂分化及減數(shù)分裂的啟動(dòng)都發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)Stra8基因敲除的雄性小鼠不育[13]。但是關(guān)于Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制目前仍未能完全闡明。Yu等發(fā)現(xiàn)miR-34c可能通過(guò)作用在Nanos2的3’UTR上抑制其表達(dá)，而這將導(dǎo)致Stra8 、Scp3及 Dazl的表達(dá)上調(diào)，而促進(jìn)減數(shù)分裂進(jìn)程[14]。Wang等發(fā)現(xiàn)在雞的睪丸內(nèi)miR-31 可以通過(guò)作用在靶基因Stra8的3’UTR（非編碼區(qū)）上直接抑制Stra8的表達(dá)進(jìn)而阻滯減數(shù)分裂的進(jìn)程[15]。而有關(guān)miRNAs與Stra8之間的關(guān)系目前仍未完全闡明。信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)mmu-miR-194-5p是Stra8上游的靶向miRNA。而目前有關(guān)miR-194-5p的研究?jī)H僅是著重在它在各種腫瘤及免疫性疾病上的作用[16-19]。而有關(guān)miR-194-5p與Stra8之間的調(diào)控關(guān)系及它們?cè)诰影l(fā)生中的作用目前仍未有任何報(bào)道。是否有可能miR-194-5p可以在精子發(fā)生的特定階段被激活，從而發(fā)揮對(duì)Stra8的調(diào)控作用呢？因此研究miR-194-5p與Stra8之間的關(guān)系對(duì)揭示Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作中已構(gòu)建了Stra8過(guò)表達(dá)精原細(xì)胞株，將其命名為Stra8-GC1-spg。為了進(jìn)一步研究miR194-5p與Stra8之間的調(diào)控關(guān)系，本研究采用了慢病毒重組質(zhì)粒pMSCV-PIG-miR194-5p來(lái)包裝293T細(xì)胞，產(chǎn)生慢病毒顆粒。為了檢測(cè)該慢病毒是否包裝成功，我們將獲得的病毒上清首先感染了293T細(xì)胞，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，pMSCV-PIG-miR194-5p慢病毒感染組，miR194-5p表達(dá)水平明顯增高。說(shuō)明該慢病毒已經(jīng)包裝成功。本實(shí)驗(yàn)中所用的pMSCV-PIG空載質(zhì)粒帶有GFP標(biāo)簽，能使細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光。轉(zhuǎn)染293T時(shí)使用的PEI(Polyethylenimine)是一種聚合物轉(zhuǎn)染試劑，它是運(yùn)用最廣泛及最有效的非病毒載體之一[20]。PEI每相隔二個(gè)碳原子就有1個(gè)氨基，構(gòu)成了多聚網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它具有大量的正電荷，能使 DNA 縮合成顆粒狀。PEI/DNA 復(fù)合物通過(guò)靜電作用吸附到細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[21]。PEI 幾乎可在任何 pH 條件下都能夠吸收質(zhì)子，這使其具有質(zhì)子海綿的作用[22]。這一特性使 PEI能在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中吸收 H+，進(jìn)而增高內(nèi)涵體內(nèi)的滲透壓，導(dǎo)致膜不穩(wěn)定甚至破裂，從而使PEI/DNA復(fù)合物從內(nèi)涵體內(nèi)逃逸出來(lái)，避免 DNA 降解。一般認(rèn)為，PEI 的基因轉(zhuǎn)染效率隨其相對(duì)分子質(zhì)量的增大而提高。這是由于 PEI 相對(duì)分子質(zhì)量越大，其質(zhì)子海綿作用越強(qiáng)，PEI/DNA 復(fù)合物就更快的被釋放入胞質(zhì)，從而減少了內(nèi)涵體對(duì) DNA 的降解，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)染效率[23]。重要的是PEI以鹽酸鹽形式提供，大大提高了水溶性。與Lipofectamine 2000相比，PEI轉(zhuǎn)染效率更高，且細(xì)胞凋亡率更低[24]。我們用該慢病毒感染Stra8-GC1-spg細(xì)胞72h后，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)miR194-5p的Stra8-GC1-spg細(xì)胞株。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量分析發(fā)現(xiàn)miR194-5p 在Stra8-GC1-spg細(xì)胞中miR194-5p的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著性增高。當(dāng)我們應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染精原細(xì)胞株時(shí)轉(zhuǎn)染效率很低，但用此方法包裝出的慢病毒感染Stra8-GC1-spg細(xì)胞使感染效率大大提高，因而更加有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。本研究采用的慢病毒系統(tǒng)優(yōu)于一般的商品化的慢病毒感染系統(tǒng)，既具有GFP熒光示蹤系統(tǒng)，又能夠通過(guò)嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞的篩選。

總之，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR194-5p 的Stra8-GC1-spg細(xì)胞株。這種細(xì)胞系可以作為一種細(xì)胞模型用于后續(xù)研究miR194-5p與Stra8之間的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步揭示Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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