寧心強(qiáng) 魏金瑛 鄭艷青 梁浩 曹存巍

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021；2.廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.柳州市中醫(yī)院，柳州 545001；4.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院&生命科學(xué)研究院，南寧 530021)

馬爾尼菲籃狀菌 (Talaromycesmarneffei, TM)，原名馬爾尼菲青霉菌 (Penicilliummarnef-fei)是溫度依賴(lài)性雙相真菌，在我國(guó)廣西、廣東以及東南亞呈區(qū)域性流行[1-2]，主要感染免疫低下人群，特別是HIV患者，若得不到有效治療，病死率極高[3-4]。TM首先侵犯單核吞噬系統(tǒng)。在巨噬細(xì)胞內(nèi)，TM面對(duì)溫度、滲透壓的急劇變化及活性氧的殺傷，如何適應(yīng)并有效定植對(duì)研究其致病性極為關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，高滲透性甘油促絲裂原活化蛋白激酶通路 (Hog1-MAPK)，參與多種真菌的滲透壓、氧化應(yīng)激以及形態(tài)轉(zhuǎn)換等，是影響真菌致病力的因素之一[5-7]。HOG1基因在絲狀真菌構(gòu)巢曲霉等稱(chēng)為SakA(stress-activated kinase)。在對(duì)TM的研究發(fā)現(xiàn)，SakA(Hog1)在抵御熱應(yīng)激、滲透壓及氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用[8-10]，但目前對(duì)該基因在小鼠致病和藥物壓力的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們通過(guò)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)及感染小鼠模型，探討SakA在TM侵襲性感染中的作用，比較SakA敲除株和野生株在藥物壓力下的生長(zhǎng)情況，探討SakA在酵母相對(duì)棘白霉素不敏感的機(jī)制，為闡明TM的致病性提供生物學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

T.marneffei2株，1株是由墨爾本大學(xué)Alex Andronopolous教授惠贈(zèng)的野生株FRR2161；另1株是SakA敲除株 (ΔsakA)，由原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化技術(shù)敲除SakA基因獲得，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。菌株均經(jīng)過(guò)TM雙相性及形態(tài)學(xué)或分子生物學(xué)鑒定，敲除株經(jīng)Southern blot驗(yàn)證。藥敏實(shí)驗(yàn)選近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控株，由北京大學(xué)真菌研究中心惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)院惠贈(zèng)。

1.3 抗真菌藥物

卡泊芬凈 (CPFG)，米卡芬凈 (MCFG)，伊曲康唑 (ITC)，伏立康唑 (VOC)，氟康唑 (FLC)和兩性霉素B (AmB)。以上藥物全為原粉，均購(gòu)于美國(guó)sigma公司，其純度≥99%。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株活化及菌懸液制備

將FRR和ΔsakA分別接種于SDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d。各實(shí)驗(yàn)菌株在ANM (A.nidulans minimal)培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種3次，每次鏡下觀察菌絲形態(tài)。挑取適量菌落置于預(yù)裝有3 mL滅菌用水的50 mL離心管中，震蕩后靜置10 min，吸取上清，過(guò)濾去除菌絲，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸液濃度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案用滅菌用水調(diào)整孢子濃度。

2.2 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)

準(zhǔn)備6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞104cell，每孔加入105孢子 (FRR/ΔsakA)，孢子加入前預(yù)先予鈣熒光白染色10 min，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)孢子形態(tài)。另準(zhǔn)備6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞105cell，每孔加入106孢子 (FRR/ΔsakA)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)2 h，PBS洗去未被吞噬的孢子，繼續(xù)共培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，冷PBS裂解細(xì)胞，裂解物按1∶100稀釋后取100 μL于YPD培養(yǎng)皿涂板，25℃培養(yǎng)72 h后計(jì)算菌落數(shù)?？瞻讓?duì)照組不加孢子。

2.3 FKS1和CHS基因的表達(dá)

挑取適量菌體分別在25℃和37℃恒溫培養(yǎng)搖床震蕩培養(yǎng)72 h后，過(guò)濾培養(yǎng)液，收集菌絲。采用Trizol法提取真菌RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)測(cè)定1,3-β-D葡聚糖和幾丁質(zhì)的編碼基因 (FKS1和CHS)表達(dá)，benA(beta-tubulin gene)為內(nèi)參基因。引物序列、反應(yīng)體系和條件參照Suwunnakorn S所做的研究[12]。利用擴(kuò)增循環(huán)數(shù) (Threshold Cycle, Ct )計(jì)算FKS1和CHS基因相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算公式：△Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)量=2^(-△△Ct)。兩組間基因表達(dá)差異運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2.4 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

制備菌液及藥物儲(chǔ)存液 菌懸液調(diào)整至 (1～5)×106CFU/mL，用RPMI 1640稀釋成 (1～5)×104CFU/mL的兩倍終濃度的菌懸液。用滅菌水將氟康唑、卡泊芬凈、米卡芬配制成1 280 mg/L；用DMSO將兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑配成1 600 mg/L，儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前根據(jù)需要用RPMI 1640稀釋。

藥敏板配制 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，從第1列到第10列每孔加入藥物稀釋液100 μL，各藥物濃度范圍：CPFG及MCFG為0.25～32 μg/mL，F(xiàn)LC 0.125～64 μg/mL，ITC 0.03～16 μg/mL，AmB 0.125～16 μg/mL，VOC 0.03～16 μg/mL。取100 μL RPMI 1640 (不含藥液)加入第11列作為生長(zhǎng)對(duì)照，取200 μL RPMI 1640 (不含藥液)加入第12列作為陰性對(duì)照。配制好的藥敏板存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

液體培養(yǎng)基接種 除第12列陰性對(duì)照，余各孔均加入100 μL菌液，25℃及37℃下培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。每次使用質(zhì)控菌株進(jìn)行質(zhì)控。

結(jié)果判定 MIC值參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的M38-A2方案[13-14]，卡泊芬凈、米卡芬凈、氟康唑與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比，≥80%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度；伊曲康唑、伏立康唑和兩性霉素B為100%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.5 感染動(dòng)物模型

實(shí)驗(yàn)材料 Balb/c小鼠，雌雄不限，體重 (20±2) g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心；將孢子懸液調(diào)整至107/mL和109/mL，分別用于菌載量組和死亡率組的注射。

實(shí)驗(yàn)分組 小鼠隨機(jī)分3組：菌載量組 (每只接種孢子量106)9只；死亡率組 (每只接種孢子量108/只)9只 ；對(duì)照組9只。每只小鼠實(shí)驗(yàn)前4 d，前1天和實(shí)驗(yàn)當(dāng)天按200 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺 (濃度20 mg/mL)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天按40 mg/kg腹腔注射曲安奈德 (8 mg/mL)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天：載菌量組每只小鼠腹腔注射孢子量106，死亡率組每只小鼠腹腔注射孢子量108。對(duì)照組注射0.1 mL生理鹽水。

觀察指標(biāo) 一般情況：進(jìn)食、活動(dòng)、反應(yīng)、體重、被毛。菌載量組，感染第3、6、9天分別無(wú)菌解剖3只，收集肝脾肺，稱(chēng)重，加1 mL滅菌水研磨，收集研磨液倍比稀釋10倍、100倍、1 000倍，取100 μL于YPD平皿涂板，25℃培養(yǎng)72 h計(jì)算菌落數(shù)。所得菌落數(shù)取平均值乘以稀釋倍數(shù)，再除以組織重量，得出每只小鼠的組織菌載量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。死亡率組，每天記錄小鼠死亡的天數(shù)及只數(shù)，觀察周期為14 d，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)。

3 結(jié) 果

3.1 菌株特征

FRR和ΔsakA在ANM培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d后，顯微鏡下觀察 (見(jiàn)圖1～2)，F(xiàn)RR細(xì)樹(shù)枝狀，以帚狀枝方式產(chǎn)孢，分生孢子梗見(jiàn)豐富孢子；ΔsakA菌絲彎曲不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞異常腫脹，甚至溶解破裂，分生孢子形態(tài)畸變。鈣熒光白染色后 (見(jiàn)圖3)，F(xiàn)RR細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分布均勻，而ΔsakA細(xì)胞壁染色不均，幾丁質(zhì)異常沉積。

3.2 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)

FRR在巨噬細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量臘腸狀酵母細(xì)胞；ΔsakA在巨噬細(xì)胞內(nèi)以孢子形態(tài)存在，不能轉(zhuǎn)化成酵母細(xì)胞 (見(jiàn)圖4)。共培養(yǎng)裂解物在YPD培養(yǎng)皿上25℃，72 h生長(zhǎng)情況：空白對(duì)照組無(wú)真菌生長(zhǎng)，F(xiàn)RR組及ΔsakA組可見(jiàn)菌落形成 (見(jiàn)圖5)，且FRR組>ΔsakA組 (P<0.05)。與FRR相比，ΔsakA更易被巨噬細(xì)胞殺死 (見(jiàn)表1)。

圖125℃下，F(xiàn)RR與ΔsakA在ANM培養(yǎng)基下生長(zhǎng)7 d的產(chǎn)孢情況 (×40)圖225℃下，F(xiàn)RR與ΔsakA在ANM培養(yǎng)基下生長(zhǎng)7 d的菌絲形態(tài) (×40)圖325℃下，F(xiàn)RR與ΔsakA在ANM培養(yǎng)基下生長(zhǎng)7 d，鈣熒光白染色后細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的分布情況 (×400，紅色箭頭指示幾丁質(zhì)沉積位置)圖4FRR和ΔsakA分別與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h熒光顯微鏡下形態(tài) (×400)圖525℃ 72 h，TM不同菌株在YPD上菌落形態(tài)

Fig.1Conidial germination ofFRRandΔsakAstrains on A.nidulans minimal medium at 25℃ for 7 daysFig.2Hyphal morphogenesis ofΔsakAcompared withFRRstrains on A.nidulans minimal medium at 25℃ for 7 daysFig.3FRRandΔsakAstrains were grown for 7 days at 25℃ on ANM and stained with calcofluor white (CAL) to visualize cell walls and septaFig.4FRRandΔsakAwere co-cultured with mouse macrophages for 24 h under fluorescence microscope, respectivelyFig.5Colony morphology of different strains of TM on YPD at 25℃ for 72 h

表1CFU檢測(cè)SakA對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬TM分生孢子的影響 (X±Sn=3)

Tab.1Effect ofSakAon phagocytic conidia of macrophages detected by CFU (X±Sn=3)

組別CFU(103)Control0．00±0．00FRR42．89±4．80?ΔsakA11．67±2．06?#

注：*.P<0.01 vs control；#.P<0.05 vsΔsakA

3.3 細(xì)胞壁合成基因的表達(dá)

野生株FKS1、CHS基因mRNA表達(dá)量在37℃酵母相較25℃菌絲相明顯升高 (P<0.05)(見(jiàn)圖6)，提示TM轉(zhuǎn)化為酵母相后細(xì)胞壁成分發(fā)生變化，1,3-β-D葡聚糖和幾丁質(zhì)含量增加，這可能是TM酵母相對(duì)棘白霉素敏感性較菌絲相下降的原因。ΔsakA和FRR的基因表達(dá)顯示 (見(jiàn)圖7)：25℃菌絲相下，二者FKS1、CHS基因表達(dá)水平無(wú)差異 (P>0.05)，而37℃酵母相時(shí)ΔsakA的FKS1、CHS基因表達(dá)水與FRR相比均明顯下降 (P<0.05)。

3.4 藥物敏感試驗(yàn)

敲除株和野生株一樣，兩相形態(tài)對(duì)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的敏感性都無(wú)差異。與野生株酵母相相比，敲除株酵母相對(duì)兩性霉素B、卡泊芬凈及米卡芬凈MIC減小1～2個(gè)濃度梯度 (見(jiàn)表2)。

表2六種抗真菌藥對(duì)野生株和敲除株體外藥敏結(jié)果

Tab.2Invitrosusceptibility of six antifungal drugs to wild strains and knockout strains

藥物名稱(chēng)FRRMIC(μg/mL)ΔsakAMIC(μg/mL)菌絲相酵母相菌絲相酵母相兩性霉素B0．50．50．50．12氟康唑8844伊曲康唑0．030．030．010．01伏立康唑0．060．060．030．03卡泊芬凈21628米卡芬凈43248

3.5 感染小鼠模型

野生株感染小鼠14 d內(nèi)死亡率為100%，且感染短期內(nèi)多出現(xiàn)逆毛、體重下降、進(jìn)食減少、活動(dòng)力下降且反應(yīng)遲鈍，而敲除株感染小鼠少有上述癥狀，14 d內(nèi)死亡率僅33.3% (見(jiàn)圖8)。菌載量實(shí)驗(yàn)中，涂板后ΔsakA組絕大部分未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，與FRR組相比有明顯差異 (見(jiàn)圖9)。

4 討 論

SakA(Hog1)-MAPK信號(hào)通路參與多種真菌的滲透壓應(yīng)激、氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及形態(tài)轉(zhuǎn)換、呼吸代謝等。煙曲霉SakA-MAPK信號(hào)通路在感受氧化壓力的刺激以及外源性滲透壓變化并產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。白念珠菌Hog1-MAPK通路至少涉及三種過(guò)程：對(duì)外界壓力的反應(yīng)和適應(yīng)、形態(tài)轉(zhuǎn)換、胞壁合成，且該通路涉及多種組氨酸激酶的調(diào)控[16-17]。在馬爾尼菲籃狀菌中HOG1的同源基因?yàn)镾akA[9]，研究表明，SakA在馬爾尼菲籃狀菌環(huán)境應(yīng)激包括高熱、滲透壓以及氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用[8-10]。我們的前期工作也發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，ΔsakA在37℃及39℃下生長(zhǎng)速度明顯減慢；發(fā)芽率較野生株低，產(chǎn)孢困難；在高滲、氧化應(yīng)激下生長(zhǎng)受抑制，進(jìn)一步證實(shí)了SakA在TM抵御環(huán)境應(yīng)激的重要意義。在此基礎(chǔ)上，本研究探索SakA在TM藥物應(yīng)激以及對(duì)小鼠致病力的影響。

在本課題組前期的體外藥敏研究中發(fā)現(xiàn)，TM的雙相形態(tài)對(duì)棘白霉素類(lèi)抗真菌藥的敏感性存在較大差異。菌絲相TM對(duì)米卡芬凈敏感，而在37℃轉(zhuǎn)化為致病的酵母樣形態(tài)后對(duì)米卡芬凈敏感性明顯降低[18]。棘白霉素類(lèi)藥物作用于真菌細(xì)胞壁，通過(guò)抑制β-1,3-葡聚糖合成酶復(fù)合體活性，從而減少真菌細(xì)胞壁主要成分β-1,3-葡聚糖的合成而發(fā)揮抗真菌的作用[19]。以往認(rèn)為真菌對(duì)棘白霉素藥敏感性降低的主要原因是獲得性或固有性的FKS基因突變[20-22]。但在TM的研究中發(fā)現(xiàn)，TM的菌絲及酵母相的FKS基因序列無(wú)改變，但存在該基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的明顯差異；同時(shí)TM轉(zhuǎn)化為酵母相后細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成酶編碼基因CHS表達(dá)明顯升高[23-24]。因此，我們推測(cè)，TM從菌絲相轉(zhuǎn)化為酵母相后，F(xiàn)KS1基因無(wú)突變，但該基因及幾丁質(zhì)合成的編碼基因CHS表達(dá)量發(fā)生了變化以及由此引起的細(xì)胞壁成分變化，可能參與了TM酵母相對(duì)棘白霉素類(lèi)藥物不敏感的發(fā)生。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SakA可調(diào)控細(xì)胞壁FKS、CHS基因的表達(dá)，ΔsakA敲除株FKS1、CHS表達(dá)量低于野生株FRR。在體外藥敏試驗(yàn)中，ΔsakA敲除株的酵母相對(duì)卡泊芬凈、米卡芬凈的敏感性較野生株明顯升高。由此提示，SakA信號(hào)通路在TM酵母相應(yīng)對(duì)棘白霉素的殺傷時(shí)，通過(guò)調(diào)控TM細(xì)胞壁合成編碼基因，引起細(xì)胞壁成分改變，從而導(dǎo)致TM酵母相對(duì)棘白霉素類(lèi)藥物敏感性降低。

圖6在25℃及37℃下，野生株FKS1和CHS基因的表達(dá)水平 (P<0.05)圖725℃、37℃下，F(xiàn)RR和ΔsakA的FKS1和CHS基因表達(dá)水平 (25℃下，兩者基因表達(dá)差異P>0.05；37℃，兩者基因表達(dá)差異P<0.05)圖8FRR和ΔsakA分別感染小鼠14 d后的生存曲線(xiàn) (P<0.05)圖9FRR和ΔsakA分別感染小鼠6 d后的內(nèi)臟 (肝、脾、肺)菌載量

Fig.6Expression levels ofCHSandFKS1 at both 25℃ and 37℃ inFRRFig.7Expression levels ofCHSandFKS1 at both 25℃ and 37℃ in each strainsFig.8Survival curves of mice infected withFRRandΔsakAfor 14 days respectively (P<0.05)Fig.9The visceral (liver, spleen, lung) fungal load of mice infected withFRRandΔsakArespectively after 6 days

對(duì)多種真菌病原體的研究中發(fā)現(xiàn)，SakA(Hog1)是真菌重要的毒力因子[25-30]。在我們建立的TM與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及TM感染動(dòng)物模型中，與野生株相比，SakA基因敲除后在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)不能轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍赶?，抵御巨噬?xì)胞殺傷的能力明顯減弱；同時(shí)在感染小鼠的各個(gè)臟器中SakA敲除株繁殖能力明顯減弱，致病力顯著下降。提示SakA在TM抵御宿主免疫細(xì)胞殺傷，侵襲感染中發(fā)揮重要作用，是TM重要的毒力因子。

綜上所述，馬爾尼菲籃狀菌SakA-MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因SakA在馬爾尼菲籃狀菌抵御環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并參與調(diào)控細(xì)胞壁成分變化，與其酵母相對(duì)棘白霉素類(lèi)藥物不敏感相關(guān)。此外，SakA是TM重要的毒力因子，在對(duì)小鼠致病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。SakA-MAPK信號(hào)通路上其他基因是否與SakA基因協(xié)同參與馬爾尼菲籃狀菌抵抗外界應(yīng)激反應(yīng)，有待進(jìn)一步的研究開(kāi)展。

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