徐國(guó)銀 談為忠 楊利慧 馬海田

（1.江蘇省蘇州市吳中區(qū)金庭動(dòng)物防疫站，江蘇蘇州 215111；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

在正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡，適當(dāng)含量的活性氧自由基對(duì)機(jī)體具有積極的生理作用。但在病理?xiàng)l件下，機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)之間平衡的破壞，機(jī)體內(nèi)活性氧（ROS）含量相對(duì)升高，超過(guò)對(duì)其的清除能力，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，繼而引起機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，DNA和蛋白質(zhì)的氧化損傷增強(qiáng)，最終會(huì)增加機(jī)體發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、衰老、癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

H2O2作為一種重要的活性氧物質(zhì)，其極易穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+通過(guò)fenton反應(yīng)產(chǎn)生較高活性的羥自由基（·OH），繼而引起一系列反應(yīng)。H2O2來(lái)源廣泛，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，目前已成為國(guó)內(nèi)外研究細(xì)胞氧化應(yīng)激的首選誘導(dǎo)劑。機(jī)體自由基含量增高，是導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要原因之一。肝臟作為機(jī)體最重要的代謝器官，其功能障礙會(huì)增加內(nèi)毒素含量，引發(fā)機(jī)體各種疾病的發(fā)生、發(fā)展。其他應(yīng)激，如熱應(yīng)激等也可導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激的發(fā)生。因此，本試驗(yàn)以大鼠肝細(xì)胞系（BRL-3A）為研究對(duì)象，探討不同濃度H2O2對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，以期為深入研究肝臟抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；噻唑藍(lán)（MTT）粉劑、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒、過(guò)氧化物酶（POD）測(cè)試盒、細(xì)胞丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒、蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；H2O2（分析級(jí)，29.0%～32.0%）購(gòu)自美國(guó) Amresco 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng) 將液氮中凍存的BRL-3A細(xì)胞取出后放入37 ℃恒溫水浴箱中迅速融化。用75%乙醇擦拭凍存管，在無(wú)菌條件下，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液洗滌后，以1000 rpm/min 離心3 min，棄上清。將細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液懸浮，然后移至10cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。次日更換含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)觀察。待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。所有試驗(yàn)均使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將BRL-3A細(xì)胞按1×105ml-1接種于96 孔板，37℃ 培養(yǎng) 24 h 后分別用 0、50、100、150、200和300 μmol·L-1（n =10）的H2O2處理，分別于作用 0.5、1、2、4 和 8 h 后向每孔加入20 μl 5mg·mL-1MTT，37 ℃孵育4 h；吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解結(jié)晶，微型振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光值（D490）。

1.2.3 Annexin V-PI 雙染分析細(xì)胞凋亡率 將BRL-3A細(xì)胞按1×105ml-1接種于6孔板，37℃培養(yǎng) 24 h 后分別用0、50、100、150、200和300 μmol·L-1（n =10）的H2O2處理2 h后，0.25%胰酶消化、離心后收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用 PBS 清洗1次，加入195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液，再加入5 μl AnnexinV-FITC 和 10 μl碘化丙啶（PI）染色液，混勻，室溫避光30 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.4 ROS 含量的檢測(cè) 細(xì)胞處理同1.2.3。細(xì)胞處理結(jié)束后，消化、離心后收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用 PBS 清洗1次，按照1：1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，收集細(xì)胞并用 PBS洗滌細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量。

1.2.5 抗氧化物酶（SOD、CAT、POD、GSH-Px）活性測(cè)定 細(xì)胞處理同 1.2.3。細(xì)胞處理結(jié)束后消化、離心、收集細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞，2500 rpm/min 離心20min后收集上清。BCA 蛋白測(cè)試盒測(cè)定蛋白濃度，比色法分別測(cè)定細(xì)胞液的 D450、D405、D420和D550值。

1.2.6 蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定 細(xì)胞處理同 1.2.3。細(xì)胞處理結(jié)束后消化、離心、收集細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞，12000 rpm/min 離心15min后收集上清。BCA 蛋白測(cè)試盒測(cè)定蛋白濃度，比色法測(cè)定上清液中D370值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以Mean ± SE 表示，用Graphpad prism 5.0和SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA 方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響

BRL-3A細(xì)胞經(jīng)0～300 μmol·L-1的H2O2分別處理0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h后，發(fā)現(xiàn)0～300 μmol·L-1的H2O2處理BRL-3A細(xì)胞0.5 h對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著性影響（P>0.05）；150～300 μmol·L-1的H2O2處理BRL-3A細(xì)胞1～8 h時(shí)細(xì)胞活力極顯著降低（P<0.01）；100 μmol·L-1的H2O2處理BRL-3A細(xì)胞2 h開(kāi)始，細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05），而在相同處理?xiàng)l件下，2～8 h細(xì)胞活力無(wú)顯著性變化（P>0.05）。綜合以上結(jié)果，本試驗(yàn)選取H2O2處理時(shí)間為2 h。

2.2 H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-PI 雙染分析結(jié)果顯示，與對(duì)照相比（0 μmol·L-1H2O2），25～50μmol·L-1的H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著性影響（P>0.05）；100 μmol·L-1的H2O2處理有增加BRL-3A細(xì)胞的凋亡率的趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）；150～300 μmol·L-1的H2O2處理極顯著增加BRL-3A細(xì)胞的凋亡率（P<0.01），且與濃度呈正相關(guān)。

表1 H2O2對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響

圖1 H2O2處理對(duì)BRL-3A 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞ROS含量的影響

圖2 H2O2處理對(duì)BRL-3A 細(xì)胞ROS含量的影響

DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，25～100 μmol·L-1的H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞的活性氧含量無(wú)顯著性影響（P>0.05）；150～500 μmol·L-1的H2O2處理極顯著增加BRL-3A細(xì)胞活性氧含量（P<0.01），且與濃度呈正相關(guān)。

2.4 H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量的影響

由表2可知，與對(duì)照相比，25～50 μmol·L-1的H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞的蛋白質(zhì)羰基含量無(wú)顯著性影響（P>0.05）；100 μmol·L-1的H2O2處理顯著增加BRL-3A細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量（P<0.05）；150～300 μmol·L-1的H2O2處理極顯著增加BRL-3A細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量（P<0.01），且與濃度呈正相關(guān)。

2.5 H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞抗氧化物酶活性的影響

由表3可知：與對(duì)照相比，25～50 μmol·L-1的H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞的SOD、CAT、POD的活性均無(wú)顯著性影響（P>0.05）；100～300 μmol·L-1的H2O2處理顯著降低BRL-3A細(xì)胞的SOD、CAT、POD的活性（P<0.05），且與濃度呈正相關(guān)。與對(duì)照相比，25～300 μmol·L-1的H2O2處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞的GSHPx的活性無(wú)顯著性影響（P>0.05）。

表2 H2O2對(duì)BRL-3A細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量的影響

表3 H2O2對(duì)BRL-3A細(xì)胞抗氧化物酶活性的影響

3 討論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡導(dǎo)致的應(yīng)激損傷狀態(tài)，可導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷，被認(rèn)為是引起衰老及疾病的重要因素之一[11]。肝臟是動(dòng)物機(jī)體的核心代謝器官，被稱(chēng)為體內(nèi)化學(xué)工廠。其含有大量的線粒體，線粒體呼吸鏈能夠利用電子傳遞產(chǎn)生 ATP，為細(xì)胞各種生理活動(dòng)提供基礎(chǔ)能量的同時(shí)，也產(chǎn)生大量ROS，如果沒(méi)有相應(yīng)的抗氧化機(jī)制，就會(huì)引起肝細(xì)胞損傷。機(jī)體的各個(gè)組織和細(xì)胞內(nèi)都有抗氧化系統(tǒng)，其中肝細(xì)胞具有相對(duì)較多的抗氧化相關(guān)酶，因而具有更強(qiáng)的抗氧化功能。

H2O2作為ROS在體內(nèi)的重要存在形式，可穿透細(xì)胞并對(duì)其造成損傷。本試驗(yàn)以H2O2為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探討了不同濃度的H2O2對(duì)BRL-3A細(xì)胞體外氧化損傷的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2可誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞凋亡，其凋亡程度與H2O2濃度呈正相關(guān)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果表明，150～300 μmol·L-1H2O2處理BRL-3A細(xì)胞 1～8 h后細(xì)胞活力均極顯著降低，但H2O2作用時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷甚至死亡。因此，選擇H2O2處理 2 h作為后續(xù)研究H2O2誘導(dǎo)BRL-3A氧化損傷的處理?xiàng)l件。

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，150～300 μmol·L-1的H2O2處理BRL-3A細(xì)胞2 h極顯著增加細(xì)胞的凋亡率。該結(jié)果提示，H2O2可誘導(dǎo)BRL-3A 細(xì)胞凋亡，并與濃度呈正相關(guān)。ROS 是生物機(jī)體有氧代謝過(guò)程中的一種副產(chǎn)物，本試驗(yàn)中H2O2處理BRL-3A細(xì)胞后，胞內(nèi)的 ROS 含量出現(xiàn)顯著升高，說(shuō)明在BRL-3A 細(xì)胞內(nèi)主要是通過(guò) Fenton 反應(yīng)轉(zhuǎn)化成·OH，使胞內(nèi)的 ROS 含量大幅度增加而造成細(xì)胞的氧化損傷。本試驗(yàn)中 H2O2處理后胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高，且與濃度呈正相關(guān)。蛋白質(zhì)羰基作為氧化應(yīng)激的敏感指標(biāo)，其生成量的多少能間接地反映 H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷程度。生理情況下，需氧生物體內(nèi)代謝伴隨著 ROS 不斷產(chǎn)生，同時(shí)也被機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)不斷清除，然而并不能被完全清除，剩余的部分一方面發(fā)揮生理作用，另一方面可損傷生物分子?；钚匝踔饕ㄟ^(guò)氧化修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，肽鏈斷裂、聚合及交聯(lián)，最終使得蛋白質(zhì)功能喪失，酶和受體的功能下降。這可能是 H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞中總 SOD 活性下降的原因之一。體內(nèi)外研究表明，活性氧升高可對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成羰基毒性。

SOD、POD、GSH-Px及CAT是生物體主要的酶性抗氧化劑[23，24]，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，酶性抗氧化劑活性降低或非酶性抗氧化物質(zhì)含量水平下降，可使機(jī)體組織因氧化損傷而引起功能失常。在對(duì)原發(fā)性肝癌、慢性病毒性肝炎、肝硬化失代償期等肝臟病人的研究中發(fā)現(xiàn)，血液中清除活性氧的SOD、POD、GSH-Px及CAT活性下降，其檢測(cè)結(jié)果可反映肝組織受自由基損傷的程度和作為判斷慢性肝病病情、療效及預(yù)后的一個(gè)重要生化指標(biāo)。本試驗(yàn)中，H2O2處理的BRL-3A細(xì)胞SOD、POD及CAT 活性下降，并與濃度呈正相關(guān)。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為H2O2處理增加BRL-3A細(xì)胞的活性氧含量及降低抗氧化酶活性，導(dǎo)致BRL-3A細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，提高了BRL-3A細(xì)胞的蛋白質(zhì)羰基含量及凋亡率，最終降低細(xì)胞活力。

本試驗(yàn)通過(guò)使用不同濃度H2O2處理BRL-3A細(xì)胞，探討H2O2對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，并探討各種酶在抗損傷過(guò)程中的相互作用規(guī)律，為以后深入研究動(dòng)物肝臟損傷和抗損傷保護(hù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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