覃珍珍 林昌華 陳雙林 陳紅梅 楊志春 李 宇 蔣家霞*

（1.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)新興有限公司，廣西柳州 545112；2.柳江市柳江區(qū)畜牧站，廣西柳州 545100；3.柳州市柳江區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西柳州 545100）

氨基酸是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)，與免疫系統(tǒng)的組織發(fā)生、器官發(fā)育有著極為密切的關(guān)系，其維持機(jī)體免疫機(jī)能，減少疾病的產(chǎn)生，特定的氨基酸可以抵抗或消除疾病和免疫機(jī)能抑制的產(chǎn)生。本試驗(yàn)篩選精氨酸、谷氨酰胺在仔豬階段開展研究，旨在探索斷奶仔豬在不同功能性氨基酸作用下抗應(yīng)激的免疫學(xué)機(jī)理，從營(yíng)養(yǎng)免疫角度提升仔豬抗病力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)某豬場(chǎng)；

1.2 試驗(yàn)材料

L-谷氨酰胺，產(chǎn)地為美國(guó)，白色粉末；L-精氨酸，白色結(jié)晶粉末；

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與基礎(chǔ)日糧

采用單因素隨機(jī)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。整個(gè)試驗(yàn)選取同一批次，日齡在31±2d的斷奶仔豬270頭，體重為7.5±0.25kg，單頭稱重并標(biāo)記耳號(hào)，隨機(jī)分組分為對(duì)照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組，每組3個(gè)重復(fù)欄，每個(gè)重復(fù)欄30頭，試驗(yàn)期25d。

各試驗(yàn)組的日糧營(yíng)養(yǎng)值見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方營(yíng)養(yǎng)值

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分兩個(gè)階段進(jìn)行。

試驗(yàn)階段一（36～56日齡），試驗(yàn)豬隨機(jī)分好組后，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行飼喂；

試驗(yàn)階段二（56～61日齡），在第一階段飼喂結(jié)束后，每處理組隨機(jī)挑選15頭體重相近的試豬進(jìn)行細(xì)菌脂多糖（LPS）的免疫應(yīng)激試驗(yàn)。

2 試驗(yàn)處理及樣本采集

2.1 血液指標(biāo)

在試驗(yàn)第25d，各試驗(yàn)處理組每重復(fù)隨機(jī)挑選5頭豬進(jìn)行前腔靜脈采血兩份，各5ml。用離心機(jī)2500 r/ min離心10 min，分離血清，用于血清生化指標(biāo)、免疫指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)等指標(biāo)的測(cè)定。

2.2 LPS免疫應(yīng)激試驗(yàn)

在試驗(yàn)第30d，對(duì)第25d采血的豬只腹膜注射100μg/kg的LPS，于注射3h后，所有試驗(yàn)豬進(jìn)行前腔靜脈采血兩份，具體同上。

LPS：大腸桿菌血清型055：B5，Sigma公司產(chǎn)品，注射時(shí)用生理鹽水配成含LPS 500μg/ml的溶液。

2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用EXCEL軟件進(jìn)行處理后，再用SPSS16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。

3 結(jié)果分析

3.1 應(yīng)激狀態(tài)下功能性氨基酸對(duì)仔豬體液免疫指標(biāo)的影響

表2 應(yīng)激狀態(tài)下功能性氨基酸對(duì)仔豬血清免疫球蛋白指標(biāo)影響的比較

由表2可知，在IgG方面，LPS刺激前后均以精氨酸、谷氨酰胺組數(shù)值較高，且與對(duì)照組差異均極顯著（P<0.01），而刺激后各組IgG值均有不同程度下降，其中以對(duì)照組下降幅度最大，與兩處理組差異均極顯著（P<0.01）；

在IgM方面，刺激前三組差異并不顯著（P>0.05），LPS刺激后，除精氨酸組略有下降外，其其余兩組均有不同程度上升，其中對(duì)照上升幅度最大，與兩處理組差異均顯著（P<0.05）；

3.2 應(yīng)激狀態(tài)下功能性氨基酸對(duì)仔豬炎性細(xì)胞因子水平的影響

由表3可知，在γ-干擾素（IFN-γ）方面，刺激前后均以精氨酸、谷氨酰胺組最高，且與對(duì)照組差異均極顯著（P<0.01），而刺激后各組值均有不同程度上升，且上升幅度基本相近，三組差異亦不顯著（P>0.05）；

在腫瘤壞死因子a（TNF-α）方面，LPS刺激前，以精氨酸組數(shù)值最高，與其他兩組差異均顯著（P<0.05），而刺激后，三組數(shù)值均有不同程度上升，其中對(duì)照組上升幅度最大，與其余兩組差異均極顯著（P<0.01），且LPS刺激后，對(duì)照組、精氨酸組兩組值相對(duì)較大，均與谷氨酰胺組差異（P<0.01）；

在白細(xì)胞介素1β（IL-1β）方面，刺激前以對(duì)照組數(shù)值最大，精氨酸組最小，三組相互之間差異均極顯著（P<0.01）；而刺激后，各組值均有不同程度上升，其中精氨酸、谷氨酰胺兩組上升幅度最大，均與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01），而刺激后也以谷氨酰胺組值最大，對(duì)照組最小；

表3 應(yīng)激狀態(tài)下功能性氨基酸對(duì)仔豬炎性細(xì)胞因子影響的比較

4 討論

4.1 應(yīng)激狀態(tài)下功能性氨基酸對(duì)仔豬血清免疫球蛋白指標(biāo)的影響分析

體液免疫反應(yīng)中，免疫球蛋白G（IgG）水平高低是衡量抗體產(chǎn)生的指標(biāo)之一，它能中和毒素使其失去毒性，調(diào)理、凝聚和沉淀抗原，在體液免疫中最為重要。

在本試驗(yàn)中，LPS刺激前，氨基酸組IgG值均極顯著大于對(duì)照組（P<0.01），特別是谷氨酰胺處理組，究其原因，這與Gln在細(xì)胞代謝過(guò)程中所發(fā)揮獨(dú)特的作用有關(guān)，它通過(guò)轉(zhuǎn)氨基和脫氨基，合成豐富的氨基酸，從而促進(jìn)機(jī)體分泌免疫球蛋白，而同時(shí)Gln作為代謝底物，既參與漿細(xì)胞的能量代謝又能為DNA的合成提供所需的前體物質(zhì)，對(duì)維持和促進(jìn)免疫細(xì)胞（漿細(xì)胞等）的生物活性以及保障B淋巴細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用，從而能有效緩解應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)造成的負(fù)面作用[1]。

而LPS應(yīng)激后可發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激前后結(jié)果基本一致，由結(jié)果可知，之前IgG處于較高值的組，應(yīng)激后仍然處于高位，且與對(duì)照組差異仍極顯著（P<0.01），這可能是跟應(yīng)激源的強(qiáng)弱有關(guān)。國(guó)外報(bào)道有，正常的動(dòng)物機(jī)體會(huì)自動(dòng)判斷應(yīng)激的程度，從而發(fā)起與之對(duì)應(yīng)的免疫反應(yīng)，既不過(guò)分也不會(huì)缺乏。而本試驗(yàn)中，每一組的試豬嚴(yán)格按照LPS 100μg/kg腹膜注射，因此所產(chǎn)生的應(yīng)激強(qiáng)度都是一致的。進(jìn)一步對(duì)比各組差值亦可發(fā)現(xiàn)，精氨酸、谷氨酰胺組與對(duì)照組差異均極顯著（P<0.01），說(shuō)明在應(yīng)激強(qiáng)度一致的前提下，額外補(bǔ)充精氨酸、谷氨酰胺能有效滿足應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)需求，緩解抗體的波動(dòng)。其中以谷氨酰胺的效果較優(yōu)。

4.2 應(yīng)激狀態(tài)下功能性氨基酸對(duì)仔豬炎性細(xì)胞因子水平的影響分析

研究證實(shí)，機(jī)體中IFN-γ含量的變化就暗示提高機(jī)體免疫性能的激發(fā)程度。本試驗(yàn)中，LPS刺激前，氨基酸組IFN-γ含量均高于對(duì)照組，且差異均極顯著（P<0.01），這說(shuō)明在本試驗(yàn)中精氨酸、谷氨酰胺對(duì)提高機(jī)體中IFN-γ含量有促進(jìn)作用，間接證明正常情況下額外補(bǔ)充精氨酸、谷氨酰胺有利于仔豬機(jī)體保持一種免疫系統(tǒng)低度激活的狀態(tài)，提升機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原的防御能力。而LPS急性應(yīng)激后，各組IFN-γ值均不同程度上升，且三組上升的幅度基本一致，這可能與試驗(yàn)LPS處理引發(fā)的應(yīng)激程度一致有關(guān)。

TNF-α 和IL-1β是由單核/ 巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在感染和免疫早期合成與分泌的前炎性細(xì)胞因子，當(dāng)受到創(chuàng)傷或過(guò)量的細(xì)菌或病毒感染時(shí)，對(duì)啟動(dòng)免疫反應(yīng)十分重要。然而，產(chǎn)生過(guò)量的這些炎性介質(zhì)會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康產(chǎn)生有害的影響。

本試驗(yàn)中，應(yīng)激前，精氨酸組TNF-α顯著高于對(duì)照組和谷氨酰胺組（P<0.05），這說(shuō)明精氨酸對(duì)于TNF-α的上升有一定的作用。這可能與精氨酸具有提高巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，而高濃度的精氨酸（2nmol/L）能增加單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性有關(guān)。在IL-1β方面，氨基酸組均極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。而當(dāng)LPS 刺激后，各組血漿炎性因子IL-1β和TNF-α含量急劇上升，說(shuō)明仔豬免疫系統(tǒng)被迅速而且高度激活。另外各組指標(biāo)上升的規(guī)律卻也基本相似，即在刺激前較低的組，刺激后上升的幅度反而較大，反之亦然。

馮麗麗[2]等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α具有劑量、時(shí)間依賴性，即機(jī)體內(nèi)IL-1β、TNF-α的值與LPS的濃度呈緊密正相關(guān)，與作用的時(shí)間呈下開口拋物線關(guān)系。因此，由上可推斷在仔豬免疫應(yīng)激模型中，機(jī)體為有效清除炎癥源的應(yīng)激而調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α的分泌，而LPS注射劑量的高低決定了機(jī)體產(chǎn)生IL-1β、TNF-α峰值的大小，而不同免疫機(jī)能狀態(tài)或健康程度下的仔豬達(dá)到峰值的時(shí)間也不同。所以筆者認(rèn)為本試驗(yàn)中，LPS刺激前炎性因子IL-1β、TNF-α較低組的試豬說(shuō)明其擁有較好的生長(zhǎng)和免疫性能，各類營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備充分，而急性應(yīng)激后其機(jī)體能迅速而有效地調(diào)動(dòng)各種營(yíng)養(yǎng)及相關(guān)代謝反應(yīng)來(lái)消除應(yīng)激部位的炎癥反應(yīng)，又因本試驗(yàn)均按100μg/kg的劑量腹膜注射并在注射3h后統(tǒng)一采血檢測(cè)，因此應(yīng)激前較小而應(yīng)激后卻又較大漲幅正說(shuō)明機(jī)體在氨基酸的調(diào)控下能在最短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到IL-1β、TNF-α的峰值，實(shí)現(xiàn)免疫防御最大化，而上升較慢的組則需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能消除應(yīng)激源所帶來(lái)的影響。然而作者的觀點(diǎn)與前人許多研究結(jié)論不一致，因此有關(guān)作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，額外添加一定量的精氨酸或谷氨酰胺對(duì)仔豬免疫應(yīng)激均具有一定的緩解作用，從改善機(jī)體健康及提高抗病力的角度看，部分取代抗生素在生產(chǎn)上的應(yīng)用是可行的。然而，因本試驗(yàn)研究也存在些許不足，即氨基酸的添加量缺乏梯度和模擬應(yīng)激的模式為細(xì)菌脂多糖急性應(yīng)激，而生產(chǎn)中仔豬面對(duì)的多為緩慢而持久的慢性應(yīng)激，因此精氨酸和谷氨酰胺如何更為科學(xué)合理的在實(shí)際生產(chǎn)中運(yùn)用還有待進(jìn)一步摸索。

參考文獻(xiàn)

[1]肖英平，洪奇華，劉秀婷，等.谷氨酰胺對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、空腸堿性磷酸酶活性及與腸道健康相關(guān)因子基因表達(dá)的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，（8）：1438-1446.

[2]馮麗麗，張麗萍，張改平，等.脂多糖對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞分泌 IL-1β 及TNF-α 的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（3）：106-109.