任婧 張丹參 侯文書 武春陽 馬佳呈

摘 要：為了改善姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體（Cur-LCL）的穩(wěn)定性，延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，對現(xiàn)有姜黃素脂質(zhì)體（Cur-Lips）和姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化。使用乙醇注入法制備Cur-Lips，用后插法將DSPE-PEG2000插入Cur-Lips中制成Cur-LCL。結(jié)果表明：Cur-LCL外觀為圓形囊泡狀球體，平均包封率為（88.91±0.94）%，4 ℃存放15 d包封率沒有明顯變化，平均滲漏率為2.4%，具有較好的穩(wěn)定性;Cur-LCL平均粒徑為（118.4±3.2）nm（n=3），呈單峰分布，平均電位為（-12.9±0.32）mV（n=3）;以溶解度為標(biāo)準(zhǔn)對溶出介質(zhì)進(jìn)行篩選，選擇以1% Tween 80的生理鹽水為體外釋放試驗(yàn)的溶出介質(zhì)，Cur原料藥12 h基本釋放完全，Cur-Lips在36 h基本釋放完全，累計釋放率為92.67%，Cur-LCL在72 h基本釋放完全，累計釋放率為91.36%。Cur-LCL具有明顯的緩釋性，可以延長藥物在血液中的循環(huán)時間，達(dá)到長循環(huán)的效果。

關(guān)鍵詞：中藥藥劑學(xué);姜黃素;長循環(huán)脂質(zhì)體;包封率;體外釋放

中圖分類號：R844.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1542（2018）06-0532-08

姜黃素（Cur）[1]是從姜科植物姜黃、莪術(shù)、郁金等根莖中提取的一種天然黃色色素，是小分子植物酸性多酚，具有多種藥理作用，且毒性很低[2-3]。近年來發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制β淀粉樣蛋白（Aβ）的合成與蓄積，改善阿爾茨海默病患者的空間學(xué)習(xí)記憶能力[4]。但是，姜黃素本身因水溶性差、生物利用度低、半衰期短、易降解[5]、不能通過血腦屏障等缺點(diǎn)而制約了自身的發(fā)展[6]。

脂質(zhì)體可以將姜黃素包裹在脂質(zhì)雙分子層中，用于克服水溶性差和生物利用度低的問題[7-8]，而DSPE-PEG2000可以經(jīng)后插法插入姜黃素脂質(zhì)體（Cur-Lips）的磷脂雙分子層中[9-11]，制成長循環(huán)姜黃素脂質(zhì)體（Cur-LCL）。筆者對此進(jìn)行了研究，修飾后的長循環(huán)脂質(zhì)體可以避免靜脈給藥后血液中巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)體的吞噬作用，具有明顯的緩釋效果，可延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間[12]，提高藥物的穩(wěn)定性，達(dá)到長循環(huán)的作用[7]。

1?實(shí)驗(yàn)部分

1.1?主要材料與儀器

姜黃素（西安小草植物科技有限責(zé)任公司提供，XC20160815）;姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定研究院提供，110823-201405）;蛋黃卵磷脂（上海艾韋特（A.V.T.）醫(yī)藥科技有限公司提供，PC-98T，注射級）;膽固醇（上海艾韋特（A.V.T.）醫(yī)藥科技有限公司提供，注射級）;DSPE-PEG2000（上海艾韋特（A.V.T.）醫(yī)藥科技有限公司提供，B50845，注射級）;葡聚糖G-50凝膠;乙腈（色譜純）;冰醋酸（色譜純）;其余試劑均為分析純。

BT 224S電子天平，BT100-2J蠕動泵，RE201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，4-15高速離心機(jī)，ZEN3690粒度分析儀，e2695 高效液相色譜儀，H-7650 透射電鏡，MODUL YOD-230真空冷凍干燥機(jī)，RC8MD溶出試驗(yàn)儀。

1.2?長循環(huán)姜黃素脂質(zhì)體（Cur-LCL）的制備

采用乙醇注入法制備姜黃素脂質(zhì)體[13-14]。分別精密稱取姜黃素、蛋黃卵磷脂、膽固醇適量，溶解在少量無水乙醇中，超聲助溶，于40 ℃水浴條件下將無水乙醇溶液滴加到去離子水中，水浴攪拌10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇，得到姜黃素脂質(zhì)體（Cur-Lips）。精密稱取DSPE-PEG2000適量，加入到Cur-Lips中，在EDC和NHS催化下于50 ℃孵育1 h，得到Cur-LCL。

1.3?處方工藝優(yōu)化

1.3.1?單因素優(yōu)化制備處方

以包封率為評價指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察投藥量、膽固醇用量、無水乙醇用量和DSPE-PEG2000用量對Cur-LCL包封率的影響。

1.3.2?正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝

以包封率為評價指標(biāo)，以水浴溫度、攪拌速度、滴加時間和水合時間為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化制備工藝，因素與水平見表1。

1.4?理化性質(zhì)考察

1.4.1?包封率（ER）的測定

采用微柱離心法測量Cur-LCL的包封率。取適量Cur-LCL，滴加于葡聚糖G-50凝膠柱的頂端，離心收集濾液。用適量去離子水洗脫3次，合并濾液于容量瓶中破乳定容，測量吸光度，計算脂質(zhì)體中包裹的藥物含量：

1.4.2?形態(tài)

取適量Cur-LCL，滴在碳支持膜銅網(wǎng)表面上，靜置2 min，使Cur-LCL充分吸附在銅網(wǎng)上。以2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）磷鎢酸染液染色2 min，置于透射電鏡下觀察形態(tài)。

1.4.3?粒徑與電位

取1 mL的Cur-LCL，加入9 mL去離子水稀釋至10倍，使用馬爾文粒度分析儀分別測定Cur-LCL的粒徑和電位。

1.5?體外釋放試驗(yàn)

1.5.1?溶出介質(zhì)的選擇

分別精密稱取5份相同且過量的Cur原料藥，加入到去離子水、PBS（pH值為7.4）、含1% Tween 80的PBS（pH值為7.4）、生理鹽水、含1% Tween 80生理鹽水中，于37 ℃下攪拌48 h，10 000 r/min離心3 min。取上清液測定Cur含量，選擇對Cur溶解度較高的溶出介質(zhì)作為體外釋放實(shí)驗(yàn)的溶出介質(zhì)。

1.5.2?溶出曲線的繪制[15]

分別取Cur-LCL，Cur-Lips和等量的游離Cur各3份，置于煮沸處理過的透析袋中，將透析袋封口，懸掛于200 mL的溶出介質(zhì)中。水浴溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r /min，于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，24，36，48，72 h 時各取樣2 mL，同時補(bǔ)加2 mL溶出介質(zhì)。將取出的溶液過0.22 μm微孔濾膜后，測定Cur含量，計算累計釋放率，并繪制溶出曲線。

2?結(jié)果與討論

2.1?處方工藝優(yōu)化

2.1.1?單因素優(yōu)化制備處方

通過對投藥量、膽固醇用量、無水乙醇用量和DSPE-PEG2000用量進(jìn)行考察，得到單因素試驗(yàn)結(jié)果，見圖1。

脂質(zhì)體內(nèi)蛋黃卵磷脂負(fù)載能力有限[16]，當(dāng)?shù)包S卵磷脂的量固定不變時，投藥量超過1.5 mg后包封率急劇下降，所以1.5 mg達(dá)到了脂質(zhì)體當(dāng)前可以包裹藥物的負(fù)載上限。膽固醇可以增加脂質(zhì)的流動性，改善脂質(zhì)體的外觀和包封率，但膽固醇量過大時會導(dǎo)致脂質(zhì)體不穩(wěn)定，膽固醇為10 mg時包封率較高。本試驗(yàn)用無水乙醇溶解藥物和輔料，無水乙醇用量較少時會導(dǎo)致藥物與輔料的濃度增高，在形成脂質(zhì)體過程中容易包裹不均勻，造成包封率不高，無水乙醇用量達(dá)到3 mL及以上時脂質(zhì)體包封率變化不大。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，如果DSPE-PEG2000和蛋黃卵磷脂的質(zhì)量比超過10%，DSPE-PEG2000將很難插入脂質(zhì)體的磷脂雙分子層，并且很容易與磷脂形成混合膠束[17-18]。故選取10%以內(nèi)的比例進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)DSPE-PEG2000與磷脂的質(zhì)量比為7%時，包封率較高。

2.1.2?正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，各因素對包封率的影響順序?yàn)橐蛩谻>因素A>因素D>因素B，制備Cur-LCL的適宜工藝為水浴溫度40 ℃、攪拌速度300 r/min、水合時間10 min、滴加時間120 s。

2.2?理化性質(zhì)

2.2.1?包封率的測定

分別在葡聚糖-G50凝膠柱頂端滴加Cur-LCL和同等濃度的游離Cur，離心收集濾液，破乳定容測量吸光度，再用適量去離子水洗脫19次，分別破乳定容測量吸光度，繪制洗脫曲線，如圖2所示。

由圖2可以看出，Cur-LCL和游離藥物可以良好分離，且重復(fù)測定RSD值≤2%，說明微柱離心法適用于本試驗(yàn)的包封率測定。

按照較優(yōu)處方制備工藝分別制備3批Cur-LCL，計算各組的包封率和載藥量，結(jié)果如表3所示。由表3可從看出，平均包封率為88.91%，平均載藥量為1.88%，RSD值均小于2%，說明制備方法穩(wěn)定，重復(fù)性較好。于4 ℃保存7，10，15 d后再次測量包封率，結(jié)果見表4。

Cur-LCL在4 ℃條件下儲存7 d時測量包封率，并無明顯變化，10 d時脂質(zhì)體包封率開始出現(xiàn)輕微下降，15 d時測量平均滲漏率為2.4%，證明Cur-LCL具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.2?透射電鏡結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，Cur-LCL在2個倍數(shù)下均為圓球形囊泡結(jié)構(gòu)，無明顯黏連，未見聚集，分布比較均勻。

2.2.3?粒徑與電位

Cur-Lips的粒徑分布圖見圖4，Cur-LCL的粒徑、電位分布圖見圖5和圖6。由圖4—圖6可以看出：Cur-Lips平均粒徑為（110.5±2.7）nm （n=3），Cur-LCL的平均粒徑為（118.4±3.2）nm （n=3），粒徑均呈單峰分布，分布比較均勻，可見加入的DSPE-PEG2000未使脂質(zhì)體粒徑明顯增大;Cur-LCL 3次測量的平均電位為（-12.9±0.32）mV （n=3），電位絕對值較大，可以保證脂質(zhì)體之間的排斥作用力，使脂質(zhì)體較為穩(wěn)定。

2.3?體外釋放試驗(yàn)

2.3.1?溶出介質(zhì)的選擇

考察了5種溶出介質(zhì)對姜黃素的溶解能力，結(jié)果如表5所示。根據(jù)Cur在各種溶出介質(zhì)中的溶解度情況，選擇溶解度較好的含1% Tween 80的生理鹽水作為體外釋放試驗(yàn)的溶出介質(zhì)。

2.3.2?色譜條件

色譜柱：YWG-C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）;流動相：乙腈-4%冰乙酸水溶液（二者體積比為48∶52）;流速：1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長：430 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.3.3?標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用釋放介質(zhì)溶液溶解，并依次稀釋為0.1，0.5，1，2，5，10，20，50 μg/mL的溶液，用HPLC測量含量，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示。圖7表明，姜黃素質(zhì)量濃度在0.1～50 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4?精密度

分別配制10，30，50 μg/mL 3種質(zhì)量濃度的姜黃素溶液，每天測量5次，連續(xù)測量5天，分別計算日內(nèi)精密度和日間精密度。日內(nèi)精密度的RSD值分別為1.23%，0.50%和0.41%，日間精密度的RSD值分別為1.70%，0.62%和0.46%，RSD值<2%。

2.3.5?回收率

分別配制10，30，50 μg/mL 3種質(zhì)量濃度的姜黃素溶液，加入到1 mL空白脂質(zhì)體中，破乳后測量姜黃素的質(zhì)量濃度，計算回收率，結(jié)果見表6。由表6可以看出，回收率RSD值均<2%，說明輔料對Cur的含量檢測沒有影響。

2.3.6?穩(wěn)定性

配制質(zhì)量濃度為30 μg/mL的姜黃素溶液，每間隔2 h測量姜黃素的含量，測量10 h，考察姜黃素溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果見表7。由表7可以看出，姜黃素溶液在含1% Tween 80的生理鹽水中穩(wěn)定性良好。

2.3.7?體外釋放率

Cur-LCL的體外釋放曲線見圖8。

試驗(yàn)結(jié)果表明：游離Cur在12 h內(nèi)基本完全釋放，累計釋放率為96.27%，Cur-Lips在36 h時累計釋放率達(dá)到92.67%;Cur-LCL則在72 h內(nèi)基本釋放完全，累計釋放率為91.36%。這說明DSPE-PEG2000的修飾可以放慢脂質(zhì)體的釋放速度，其原因可能是DSPE-PEG2000在脂質(zhì)體表面形成了一層水滑膜，減慢了藥物的釋放，從而達(dá)到緩釋和長循環(huán)的效果[19-20]。

3?結(jié)?論

1）選用乙醇注入法制備姜黃素脂質(zhì)體（Cur-Lips），將DSPE-PEG2000用后插法加入到姜黃素脂質(zhì)體中，得到姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體（Cur-LCL），平均包封率為（88.91±0.94）%，平均載藥量為（1.88±1.10）%，4 ℃下儲存15 d平均滲漏率為2.4%。

2）Cur-LCL外觀為圓形囊泡狀球體，平均粒徑為（118.4±3.2）nm （n=3），呈單峰分布，平均電位為（-12.9±0.32）mV（n=3），性質(zhì)較為穩(wěn)定，可以認(rèn)為是制備姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的較好方法。

3）考察了Cur在不同介質(zhì)中的溶解度，選定1% Tween 80生理鹽水作為體外釋放實(shí)驗(yàn)的溶出介質(zhì)，原料藥在12 h內(nèi)基本完全釋放，Cur-Lips在36 h內(nèi)基本釋放完全，累計釋放率為92.67%，Cur-LCL在72 h內(nèi)基本釋放完全，累計釋放率為91.36%，說明修飾了DSPE-PEG2000的Cur-LCL具有明顯的緩釋性。

4）在Cur-Lips表面修飾了DSPE-PEG2000，增加了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，延長了體外釋放時間，使得藥物在體內(nèi)的作用時間更長;此外，因?yàn)槔砘再|(zhì)更加穩(wěn)定，所以更加便于藥物的儲存和運(yùn)輸。但脂質(zhì)體普遍存在載藥量偏低的問題，當(dāng)投藥量達(dá)到輔料負(fù)載能力的上限時，隨著投藥量的增加，載藥量反而會下降，而脂質(zhì)體使用的輔料大多為天然成分，負(fù)載能力有限，今后需針對脂質(zhì)體載藥量的提高加以深入研究。

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