黎妍妍 王文靜 王林 李亞培 周紅審 陳德鑫 許汝冰 李錫宏

摘 要：為有效進行恩施煙區(qū)煙草黑脛病的防控，本研究采用菌絲塊莖基部創(chuàng)傷接種法鑒定了恩施煙區(qū)煙草黑脛病菌的致病力。根據(jù)黑脛病菌菌株接種K326、紅花大金元、云煙202后的AUDPC（病害流行曲線下面積）數(shù)值進行了聚類分析，將恩施煙區(qū)煙草黑脛病菌劃分為I、II、III 3種致病型。3種致病型病原菌沒有表現(xiàn)出典型的強、中、弱致病特性。7個抗性煙草品種對不同致病型黑脛病菌表現(xiàn)出抗性差異，革新3號對3種致病型菌株均表現(xiàn)出較好的抗性。

關(guān)鍵詞：恩施；黑脛病菌；致病力；抗性差異

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）05-0094-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.013

Abstract： In order to take effective measures to control tobacco black shank in Enshi， the virulence of Phytophthora nicotianae was analyzed by using the method of the wounded stalk inoculation with mycelia. Strains could be classified into three virulence pathotypes （I， II and III） by cluster analysis based on AUDPC （Area under Disease Progress Curve） values of three cultivars， K326， Hongda， and Yunyan202. And the three pathotypes showed atypical pathogenic characteristics. 7 resistant tobacco varieties showed different resistance to different pathotypes of Phytophthora nicotianae， and Gexin 3# showed good resistance to all three kinds of pathogenic strains.

Keywords： Enshi； Phytophthora parasitica； pathogenicity； resistant difference

煙草黑脛病是由寄生疫霉煙草致病型[Phytophthora parasitica var. nicotianae （Breda de Haan Tucker）]引起的煙草生產(chǎn)中的一種土傳病害，常表現(xiàn)為黑脛、黑膏藥、穿大褂、碟片狀、腰爛等癥狀。1950年，煙草黑脛病在中國的黃淮地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)[1]。目前，該病害在我國各主產(chǎn)煙區(qū)均有不同程度的發(fā)生，且常與煙草青枯病混合發(fā)生，故危害更為嚴(yán)重。

煙草黑脛病流行與否取決于病原菌致病性強弱和數(shù)量、煙草抗病程度和環(huán)境條件[2]，因此，進行黑脛病菌致病力測定與分析是有效進行病害防治的關(guān)鍵。在以往研究中，梁元存等[3]測定了我國黃淮、西南和東南區(qū)域等9個主產(chǎn)煙草省（區(qū)）的117株煙草黑脛病菌菌株的致病力。王革等[4]報道稱，云南省內(nèi)黑脛病菌菌株比非云南省的致病力強。劉廷利[2]通過測定重慶煙區(qū)煙草黑脛病菌菌株的致病性，認為菌株間的致病性分化明顯。這些都為不同區(qū)域煙草黑脛病的合理防控提供了良好的理論基礎(chǔ)。在過去的十幾年間，恩施煙區(qū)烤煙黑脛病菌的優(yōu)勢生理小種已由0號演變?yōu)?號[5-6]，然而，關(guān)于該區(qū)域烤煙黑脛病菌的致病力尚未進行研究。

在防治黑脛病的諸多措施中，選育抗病品種是最經(jīng)濟、有效、環(huán)保的措施[7]，品種抗性鑒定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監(jiān)測等工作中重要的一環(huán)[8]。目前，諸多研究[9]已進行了種質(zhì)資源與新品種（系）的抗性鑒定，然而關(guān)于抗性品種對不同致病型黑脛病菌的抗性差異鮮有報道。本研究旨在通過分析恩施煙區(qū)煙草黑脛病菌致病力差異，并有針對性地進行抗性品種抗性差異鑒定，為該煙區(qū)有效進行病害的防控和抗病育種工作的開展提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的采集、分離與鑒定

2016年從湖北省恩施州宣恩縣、利川市、恩施市采集烤煙（當(dāng)?shù)刂髟詿煵萜贩N為云煙87）黑脛病病株。采用直接表面消毒分離法進行黑脛病菌菌株的分離。將烤煙病株莖稈剖開、沖洗干凈并吸干水分，95%的酒精表面消毒后，從碟片狀的病健交界處取3 mm×3 mm的髓部組織接種于燕麥培養(yǎng)基（燕麥片30 g，瓊脂18 g，去離子水l000 mL）平板上，置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)2～3 d后挑取邊緣菌落進行純化。

采用CTAB 法提取供試菌株菌絲體總DNA后，運用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）對病原菌的ITS序列擴增，進行待測病原菌的分子鑒定。

1.2 黑脛病菌菌株致病力鑒定

參照相關(guān)研究[2]，選擇抗感差異不同的K326（中抗）、云煙202（抗）、紅花大金元（感）作為煙草黑脛病菌致病力測定的鑒別品種。煙苗長至5～6片真葉時，移栽到盆缽內(nèi)，每盆栽一株煙苗。供試菌株在28 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d后，用直徑0.6 cm的滅菌打孔器制成菌餅。采用菌絲塊莖基部創(chuàng)傷接種法將供試菌株制成的菌餅接種于每個煙草品種。將5～6葉期的煙苗用昆蟲針束（4根小號昆蟲針束）輕度刺傷莖基部，將菌餅貼于傷口處（生長菌絲的一面向內(nèi)與莖基部相貼），用脫脂棉蘸滅菌水覆蓋保濕24 h，置于溫度28 ℃、相對濕度80%的溫室中，每個菌株接種每品種10株煙苗。

1.3 抗性煙草品種抗性差異鑒定

根據(jù)黑脛病菌菌株致病力測定結(jié)果，以抗黑脛病煙草品種云煙203、云煙201、NC82、NC1071、Florida 301、L-8和革新3號為參試品種，對每種致病型菌株進行室內(nèi)苗期接種，鑒定參試品種對不同致病型黑脛病菌菌株的抗性差異。接種方法及條件同1.2，每品種8～10株煙苗。

1.4 發(fā)病情況調(diào)查

于接種后7 d（7dpi， 7 days post-inoculation）、14 d（14 dpi）和20 d（20 dpi）進行調(diào)查，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》中關(guān)于煙草黑脛病的分級標(biāo)準(zhǔn)記載發(fā)病情況。

1.5 統(tǒng)計分析

依據(jù)各菌株在不同烤煙品種上的AUDPC值，采用SPSS 19.0中的系統(tǒng)聚類法進行聚類分析，將黑脛病菌菌株劃分為不同的致病型。

2 結(jié) 果

2.1 煙草黑脛病菌總體致病力分析

通過對7個菌株進行分子鑒定，并在NCBI上進行序列比對，確定其為煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）。由表1可以看出，不同菌株對3個供試煙草品種致病力存在明顯差異。接種20 d后，K326、云煙202、紅花大金元3個煙草品種的病情指數(shù)分別為0～51.11、0～36.11、0～52.22。

2.2 煙草黑脛病菌致病型劃分及致病特性

根據(jù)黑脛病菌菌株接種3個煙草品種的AUDPC值，對7個菌株進行了聚類分析，將其劃分為I、II、III 3種致病型（圖1）。

不同的致病型菌株對煙草品種產(chǎn)生不同的侵染特性（表2）。I型致病菌在接種后20 d時，3個煙草品種的平均病指和AUDPC值分別為6.35和37.08，K326品種未見發(fā)病，該型菌株對紅花大金元的侵染力較強，對云煙202的侵染力較弱；II型致病菌在接種后20 d時，3個煙草品種的平均病指和AUDPC值分別為15.65和62.68，對K326的侵染力較強，但對云煙202和紅花大金元的侵染力較弱；III型致病菌在接種后20 d時，3個煙草品種的平均病指和AUDPC值分別為20.06和66.48，該型菌株對云煙202和紅花大金元的侵染力較強，但K326未見發(fā)病。

2.3 抗黑脛病煙草品種抗性差異鑒定

依據(jù)黑脛病菌菌株致病力測定結(jié)果，進行了抗性煙草品種抗性差異鑒定（表3）。接種III型（ES-1、ES-2、LC-6）致病型菌株后，革新3號未見發(fā)??；接種I型（LC-4、XE-2）致病型菌株后，云煙203、云煙201、NC1071、革新3號未見發(fā)??；接種II型（XE-3、XE-4）致病型菌株后，云煙203、革新3號未見發(fā)病?？傮w來看，革新3號對3種致病型菌株均表現(xiàn)出較好的抗性。

3 討 論

在菌絲塊莖基部創(chuàng)傷接種、游動孢子懸浮液灌根接種、菌絲塊莖基部不創(chuàng)傷接種3種常用的接種方法中，馬國勝等[10]認為菌絲塊莖基部創(chuàng)傷接種可能是測定黑脛病菌致病力的最好方法。本研究采用該方法，依據(jù)病斑在3個煙草品種上的擴展情況測定分析了恩施煙區(qū)煙草黑脛病菌菌株的致病力。

煙草黑脛病菌的致病性分化現(xiàn)象是在病原物與寄主植物長期演化過程中相互適應(yīng)和相互選擇下形成的[11]。研究表明，煙草黑脛病菌致病性強弱的表達與菌株的不同地區(qū)來源具有一定關(guān)系。梁元存等[3]測定了我國主產(chǎn)煙區(qū)的煙草黑脛病菌菌株在10個煙草品種上的致病性分化情況，結(jié)果表明我國的煙草黑脛病菌菌株間致病性存在明顯差異。本研究根據(jù)聚類分析，將恩施烤煙黑脛病菌菌株劃分為I、II、III型3種致病型，表明即使處于同一生態(tài)區(qū)域內(nèi)，菌株間仍然存在致病性分化現(xiàn)象，這與劉廷利[2]研究結(jié)論較為一致。3種致病型病原菌對3個煙草品種的致病性并沒有表現(xiàn)出以往報道[2]中的典型致病特性，I型菌對中抗品種K326無致病力，但對感病品種紅花大金元的侵染力較強，對抗病品種云煙202的侵染力較弱；II型菌對K326的侵染力較強，但對云煙202和紅花大金元的侵染力較弱；III型菌對云煙202和紅花大金元的侵染力較強，但對K326無致病力。相對而言，III型菌的致病性高于I型菌。鑒于這種非典型性致病特性，本研究沒有將鑒定出的3種致病型病原菌歸于強、中、弱。

研究表明，有些煙草品種僅抗黑脛病菌某些生理小種，說明生理小種發(fā)生改變可能導(dǎo)致抗性消失[12]。然而，關(guān)于煙草抗性品種對不同致病型黑脛病菌的抗性差異鮮有報道。本研究結(jié)果表明，對I型致病菌具有抗性的煙草品種較多，而對III型致病菌的抗性品種僅為革新3號。革新3號對I、II、III 3種致病型菌株均表現(xiàn)出較好的抗性。因此，煙草黑脛病菌致病性的差異常常導(dǎo)致某些抗性煙草品種抗病性的“喪失”。

4 結(jié) 論

本研究采用菌絲塊莖基部創(chuàng)傷接種法鑒定了恩施煙區(qū)烤煙黑脛病菌的致病力，將其劃分為I、II、III 3種致病型?；诓煌虏⌒秃诿劜【?，進行了抗性煙草品種抗性差異評價，結(jié)果表明，革新3號對3種致病型菌株均表現(xiàn)出較好的抗性。本研究為該區(qū)域煙草黑脛病的合理防控及抗性品種的布局提供了參考。

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