魏立娟 郭海 崔凌霄

摘要 本研究以對多種植物病原真菌具有抑制能力的解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens262AG6為試驗對象，使用單因素和正交試驗設(shè)計方法對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，葡萄糖25 g，KNO3 16 g，NaCl 15 g，水1 000 mL；最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度34℃，150 mL搖瓶裝液40 mL，振蕩器轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)基初始pH 9，最佳接種量為14%；其在100 L發(fā)酵罐的生長曲線為0～6 h為調(diào)整期，6～26 h為對數(shù)期，26 h后菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，即該菌最佳放罐時間為26 h。

關(guān)鍵詞 矮生嵩草； 解淀粉芽胞桿菌； 發(fā)酵培養(yǎng)基； 發(fā)酵條件； 優(yōu)化

中圖分類號： TQ 920.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018027

Abstract Bacillus amyloliquefaciens 262AG6 has inhibitory activity against a variety of plant pathogenic fungi. Single-factor and orthogonal experimental design methods were used to optimize the fermentation conditions of this bacterium. The results showed that the optimum fermentation medium included 200 g of potato， 25 g of glucose， 16 g of KNO3， 15 g of NaCl in 1 000 mL of water. The optimal fermentation conditions were as followed： shaking 40 mL liquid （the best inoculum size was 14%） in an 150 mL bottle at 150 r/min at 34℃， with an initial pH value of 9； its growth curve in the 100 L fermenter was composed of 0-6 h for the adjustment period， 6-26 h for the logarithmic phase， and the stable period after 26 h， suggesting a best fermentation time of 26 h.

Key words Kobresia humilis； Bacillus amyloliquefaciens； fermentation medium； fermentation condition； optimization

微生物發(fā)酵是指在適宜的條件下，利用微生物將原料經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需產(chǎn)物的過程[1]。微生物發(fā)酵工程具有極其強勁的發(fā)展動力，在許多學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用，微生物發(fā)酵同樣是生防微生物從實驗室培養(yǎng)研究到工業(yè)化生產(chǎn)實踐應(yīng)用過程中必須跨越的臺階。內(nèi)生細(xì)菌作為一種寶貴的天然微生物資源，在宿主防病、殺蟲、促生、耐鹽及耐干旱等能力提升方面得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]，很多植保工作者對生防微生物及其發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)行了研究報道，劉寧等[3]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisBAB-1的無菌發(fā)酵液在離體葉片上對番茄灰霉病的防治效果達(dá)70.92%；劉旭等[4]的研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciensCS5菌株對葡萄離體葉片上的霜霉病防治效果達(dá)96.23%；蔡麗等[5]的研究表明內(nèi)生細(xì)菌FH01的最佳發(fā)酵條件為麥芽提取物1.43%（m/v）， 大豆蛋白胨1.67%（m/v）， 初始pH 5.0，發(fā)酵溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵時間68 h；李喬曼等[6]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis LYM3的發(fā)酵上清液具有較高的抗菌活性，通過優(yōu)化其最適培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉2%、胰蛋白胨1%、酵母粉0.8%、NaCl 1%，初始pH 6.0，28℃，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)60 h，抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到最高；雷白時等[7]對棉花黃萎病菌Verticillium dahliae的拮抗菌多黏芽胞桿菌Bacillus polymyxa7-4產(chǎn)抑菌蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其最佳培養(yǎng)基組分為：葡萄糖5.0%，大豆蛋白胨5.0%，MgSO4·7H2O 0.10%，MnSO4 0.02%，初始pH 7.5，30℃搖床培養(yǎng)48 h，可以提高對大麗輪枝菌的抑制作用。

解淀粉芽胞桿菌菌株262AG6是本實驗室從東祁連山高寒草地矮生嵩草中分離的具有抑菌活性和多種促生功能的優(yōu)良內(nèi)生細(xì)菌，本試驗旨在通過優(yōu)化其最適發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，以期為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院保存的東祁連山高寒草地矮生嵩草內(nèi)生細(xì)菌解淀粉芽胞桿菌262AG6。

1.1.2 供試培養(yǎng)基[8-9]

肉汁胨培養(yǎng)基（NA）用于內(nèi)生細(xì)菌262AG6的活化、保存等。培養(yǎng)基A～G用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選。A：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；B：馬鈴薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；C：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖8 g，NaCl 5 g，水1 000 mL；D：牛肉膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL；E：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL；F：玉米淀粉3 g，（NH4）2SO4 10 g，KH2PO4 15 g，蔗糖10 g，水1 000 mL；G：牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，水1 000 mL。

1.1.3 試驗儀器設(shè)備

BIOF-6100B/S/B/N微生物發(fā)酵罐，上海高機(jī)生物工程有限公司；紫外/可見光分光光度計，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司，用于測定發(fā)酵液的OD600。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株262AG6的活化和種子液的制備

將保存的262AG6菌株接種于NA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)箱中活化，然后接入NA液體培養(yǎng)基中在28℃、180 r/min的條件下過夜培養(yǎng)，制得種子液備用（液體培養(yǎng)基在150 mL的錐形瓶中裝液量為50 mL）。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

將1.1.2中A～G培養(yǎng)液分裝入錐形瓶（40 mL/150 mL），調(diào)節(jié)pH 為7后滅菌，再接入種子液2 mL，恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)（28℃，180 r/min），3次重復(fù)，培養(yǎng)24 h后通過發(fā)酵液的OD600確定生物量，以確定最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.3 碳源、氮源和無機(jī)鹽的優(yōu)化

用蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、無碳源、葡萄糖分別替換1.2.2篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，其他同1.2.2，以確定最佳碳源。

用尿素、（NH4）2SO4、KNO3、NH4Cl、酵母膏、不加氮、蛋白胨、牛肉膏分別替換1.2.2篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，其他同1.2.2，以確定最佳氮源。

用MgSO4、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2、不加無機(jī)鹽離子、NaCl分別替換1.2.2篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽，其他同1.2.2，以確定最佳無機(jī)鹽。

1.2.4 最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽濃度的確定

將1.2.3篩選出的最佳碳源分別設(shè)置為0、5、10、15、20、25和30g/L、其他同1.2.2，以確定碳源的最適濃度。

將1.2.3篩選出的最佳氮源分別設(shè)置為0、4、6、8、10、12、14和16g/L，其他同1.2.2，以確定氮源的最適濃度。

將1.2.3篩選出的最佳無機(jī)鹽分別設(shè)置0、5、10、15、20、25、30、35和40 g/L，其他同1.2.2，以確定無機(jī)鹽的最適濃度。

1.2.5 碳源、氮源和無機(jī)鹽的正交試驗

根據(jù)1.2.3和1.2.4的篩選結(jié)果進(jìn)行L9（3.3）正交試驗（表1），28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液的吸光度（OD600），結(jié)果經(jīng)方差檢驗分析，確定最佳的培養(yǎng)基組合。

1.2.6 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

設(shè)定pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和自然pH，溫度為20、24、28、32、34和36℃，恒溫振蕩器轉(zhuǎn)速為120、150、180、210和240 r/min，搖瓶供氧量設(shè)置150 mL錐形瓶培養(yǎng)基裝液量為20、40、60、80和100 mL，接種量為2%、6%、10%、14%、18%和22%。利用上述培養(yǎng)條件，在1.2.5最佳培養(yǎng)基組合的基礎(chǔ)上，使用單因素試驗的方法培養(yǎng)生防菌株262AG6，通過測定發(fā)酵液的吸光度（OD600）確定生物量，優(yōu)化最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。

1.2.7 發(fā)酵罐中生長曲線的測定

使用1.2.5和1.2.6篩選出的最佳培養(yǎng)基組合和最佳培養(yǎng)條件設(shè)定發(fā)酵參數(shù)，在發(fā)酵罐中對菌株262AG6進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 h取樣，重復(fù)3次，測定發(fā)酵液的生物量（OD600），直到其OD600穩(wěn)定之后停止發(fā)酵并放罐，發(fā)酵液收集備用。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和SPSS 22.0等軟件處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及碳氮源和無機(jī)鹽的優(yōu)化

2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

試驗結(jié)果表明（圖1），菌株262AG6在B培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h達(dá)到最大生物量，其OD600為1.926，在E培養(yǎng)基中的生物量低于B培養(yǎng)基，但差異不顯著（P<0.05），從培養(yǎng)基的原料來源和成本控制方面考慮，B培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）為菌株262AG6的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.1.2 碳、氮源和無機(jī)鹽的優(yōu)化

單因素試驗結(jié)果表明，生防菌株262AG6在以葡萄糖為碳源時發(fā)酵液的吸光值為1.968，顯著高于其他組合（P<0.05），玉米淀粉為碳源時發(fā)酵液的吸光值最小，說明玉米淀粉不利于262AG6的生長（圖2）；以KNO3和NH4Cl為氮源時發(fā)酵液OD600分別為2.093和2.070，顯著高于其他氮源（P<0.05），但兩者差異不顯著，由于NH4Cl在高溫時易分解，而且KNO3可以通過多種途徑得到，因此選擇KNO3作為最佳氮源（圖3）；以MnSO4和CuSO4為無機(jī)鹽時262AG6基本不生長，說明Mn.2+和Cu.2+可以抑制菌株262AG6的生長；CaCl2和NaCl為無機(jī)鹽時發(fā)酵液OD600分別為2.49和2.180，顯著高于其他處理（P<0.05），而CaCl2和NaCl兩者間差異不顯著，但由于NaCl比CaCl2更加常見和易得，所以選擇NaCl作為最佳無機(jī)鹽（圖4）。

2.2 碳、氮源和無機(jī)鹽濃度的優(yōu)化

碳、氮源和無機(jī)鹽濃度篩選結(jié)果表明，葡萄糖濃度為25 g/L時，262AG6的生物量達(dá)到最大（圖5）；在KNO3和NaCl的濃度分別為14 g/L和15 g/L時（圖6～圖7），菌株262AG6生物量達(dá)到最大，且顯著高于其他濃度（P<0.05）。因此確定菌株262AG6的最適碳、氮源和無機(jī)鹽的濃度分別是25、14和15 g/L。

2.3 正交試驗

正交試驗對碳、氮源和無機(jī)鹽濃度優(yōu)化結(jié)果表明，9號處理的生物量顯著高于其他處理和CK（P<0.05），其OD600為2.201；因此，菌株262AG6的最適宜碳、氮源和無機(jī)鹽濃度配比組合為馬鈴薯200 g，葡萄糖25 g，KNO316 g，NaCl 15 g和水1 000 mL（表2）。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 初始pH 的優(yōu)化

最適pH篩選結(jié)果表明（圖8），菌株262AG6對pH的適應(yīng)范圍廣，在pH5～10的范圍內(nèi)均可生長，其中pH=8時生物量達(dá)到最大，OD600為2.176，顯著高于其他處理（P<0.05），說明堿性條件更適合菌株生長，在pH小于5和大于10的條件下不能正常生長，說明極端的pH條件可以抑制菌株生長。該結(jié)果表明，菌株262AG6生長的最佳pH為8。

2.4.2 溫度的優(yōu)化

試驗結(jié)果表明（圖9），262AG6能夠在20～36℃下正常生長，但在34℃時菌株生物量達(dá)到最大，OD600為2.49，之后開始下降，說明菌株生長的最適溫度為34℃。

2.4.3 裝液量和轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

試驗結(jié)果表明，菌株262AG6發(fā)酵的最佳搖瓶裝液量為150 mL搖瓶中裝液40 mL，其OD600為2.261（圖10），裝液量過高或過低菌株生物量均低于該值，即150 mL搖瓶的最佳裝液量為40 mL；轉(zhuǎn)速在120～240 r/min之間菌株均可以正常生長（圖11），在轉(zhuǎn)速為150 r/min時，發(fā)酵液的OD600為1.993，顯著高于其他轉(zhuǎn)速條件下的生物量，即最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.4.4 接種量的優(yōu)化

接種量優(yōu)化結(jié)果表明（圖12），菌株的生物量在一定范圍隨接種量的增加而增加，但接種量超過14%之后，生物量的增量不顯著，綜合考慮將最佳接種量確定為14%。

2.5 菌株生長曲線的測定

在最佳培養(yǎng)基和最優(yōu)發(fā)酵條件下，解淀粉芽胞桿菌262AG6的生物量調(diào)整期為4 h，對數(shù)期為4～26 h，在26 h處菌株生物量達(dá)到最大值，OD600為10.225，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。

3 結(jié)論與討論

近年來，化學(xué)農(nóng)藥的大規(guī)模和不合理使用造成了一系列嚴(yán)重的環(huán)境以及食品安全方面的問題，而多種微生物特別是芽胞桿菌的代謝產(chǎn)物被證明對病原物具有優(yōu)良的控制效果，具有開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，且不污染環(huán)境，對人畜安全，是化學(xué)農(nóng)藥的理想替代品，是未來植物病蟲害防治的重要方向，具有極大的研究價值。關(guān)于生防微生物的發(fā)酵培養(yǎng)國外有較多報道[10-11]，國內(nèi)報道了紅樹內(nèi)生細(xì)菌RS261[12]、枯草芽胞桿菌[13]、番茄枯萎病拮抗菌[14]等產(chǎn)抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基的優(yōu)化；本試驗通過對發(fā)酵工藝的優(yōu)化篩選，菌株262AG6的生物量從優(yōu)化前的1.926增至10.225，是優(yōu)化前的5.3倍，效果顯著，與車曉曦等[15]、李浩等[16]的研究結(jié)果優(yōu)化發(fā)酵條件可以顯著提高微生物發(fā)酵的菌體量相一致，達(dá)到了試驗預(yù)期的工業(yè)化生產(chǎn)條件。

通過前期的研究發(fā)現(xiàn)，從東祁連山高寒草地矮生嵩草中分離的內(nèi)生細(xì)菌262AG6對多種病原真菌具有良好的抑制作用[17]，本試驗優(yōu)化了262AG6菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，同時通過100 L發(fā)酵罐測定其生長曲線，結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌262AG6生長的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，葡萄糖25 g，KNO3 16 g，NaCl 15 g，水1 000 mL；最佳的培養(yǎng)條件為溫度34℃，150 mL搖瓶裝液40 mL，振蕩器轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)基初始pH 8，最佳接種量為14%，100 L發(fā)酵罐中0～4 h為調(diào)整期，4～26 h為其菌株生長的對數(shù)期，26 h后菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，因此最佳發(fā)酵時間為26 h。該研究結(jié)果與張慧等[18]對枯草芽胞桿菌CS16的研究結(jié)論相似，但與梁艷瓊等[19]對解淀粉芽胞桿菌TWC2的研究結(jié)果相比較，除最適發(fā)酵條件中溫度（34℃）與本試驗一致外，其他發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基（5 g/L麥芽糖，10 g/L果糖，10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸出粉，1 g/L CaCl2）均有很大差別，原因可能是262AG6采自東祁連山高寒草地而TWC2采自臺灣熱帶地區(qū)，氣候上的極大反差使兩個菌株的生物學(xué)特性有很大差異；與趙曉燕等[20]研究的解淀粉芽胞桿菌XLA03的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源為玉米淀粉和豆粕也不同，也可能由菌株間的生物學(xué)特性差異所致，從而造成試驗結(jié)果差異很大。大多數(shù)研究認(rèn)為芽胞桿菌屬最佳發(fā)酵pH在7左右[3，20-23]，262AG6初始pH為8，與侯美玲等[24]研究得出玉米內(nèi)生枯草芽胞桿菌的初始pH一致，且pH范圍在5～8的條件下生長良好，說明該菌株對堿性條件的耐受度較高，適應(yīng)范圍更廣，有更廣闊的應(yīng)用前景；最佳發(fā)酵時間為26 h，比魏嬌洋等[25]報道的解淀粉芽胞桿菌 X-278的最佳發(fā)酵時間為72 h縮短了接近三分之二，最佳接種量14%約為祁之秋等[26]報道的生防菌Hj33-7 30%接種量的一半，說明262AG6對培養(yǎng)條件的要求較低，在發(fā)酵過程中可節(jié)省成本和時間。解淀粉芽胞桿菌是一種植物根際促生細(xì)菌[27]，而秦宇軒等[28]利用固體發(fā)酵的方法研究得出解淀粉芽胞桿菌L-H15 能夠有效促進(jìn)植株生長，為該菌株能夠更好地在生產(chǎn)應(yīng)用中提供了有力依據(jù)，接下來應(yīng)利用固體發(fā)酵的方法對262AG6進(jìn)行研究。

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（責(zé)任編輯：田 喆）