蔡霓 王峰 農(nóng)向群

摘要 綠僵菌防治草原蝗蟲效果顯著，其在草原田間的存活能力影響其持續(xù)控害效果。除了侵染昆蟲，綠僵菌還具有在植物根際宿存和根內(nèi)生的生活方式，但相關(guān)宿存規(guī)律和內(nèi)生性的研究報道很少。本文研究了綠僵菌在內(nèi)蒙古草原兩種優(yōu)勢種植物羊草和克氏針茅根際的種群數(shù)量變化并對其在這兩種草的根內(nèi)宿存進行了鑒定。結(jié)果表明，在干旱的內(nèi)蒙古草原，綠僵菌施用后種群數(shù)量在30 d內(nèi)快速下降，但能夠以低密度在羊草、克氏針茅根際土壤中至少延續(xù)宿存75 d，羊草根際環(huán)境比較利于綠僵菌生存。對菌株egfp基因標記的特異PCR檢測證明了綠僵菌在羊草和克氏針茅根內(nèi)宿存。試驗數(shù)據(jù)為指導(dǎo)植保生物防治中充分利用綠僵菌的昆蟲病原性和植物內(nèi)生特性提供理論基礎(chǔ)，也將成為綠僵菌物種生活方式多樣性、與植物互作及共進化研究的重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 金龜子綠僵菌； 根際宿存； 植物內(nèi)生性； PCR檢測； 牧草

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018309

Abstract The application ofMetarhizium for grasshopper control has been obtained significant effect in prairie. The survivability of the appliedMetarhizium is related to its sustained control effect in the grassland. In addition to infecting insects， the fungusMetarhizium also has rhizosphere competent and endophytic lifestyle interacting with plants. However， there are few reports on the fungal persistence and endogeneity. In this paper， we studied the population dynamics and endophyticity ofM. anisopliae in the rhizosphere of two dominant plants，Leymus chinensisandStipa krylovii in Inner Mongolia grassland. The results showed that the fungal population decreased rapidly within 30 days， but it could persist at least 75 days in the rhizosphere soil of the two grass species. The rhizosphere ofL. chinensis was more conducive to the funguss survival. The endophyticMetarhizium in the grass roots was identified by PCR detection of specificegfplabeling gene in the appliedMetarhizium isolate. The experimental data provided a theoretical basis for making full use of the entomopathogenic and endophytic characteristics ofMetarhizium in plant protection. They would also become important foundation for further study on the diversity ofMetarhizium lifestyles， their interaction and co-evolution with plants.

Key words Metarhizium anisopliae； surviving in rhizosphere； endophyte； PCR detection； pasture

近年，昆蟲病原真菌的田間宿存及其與植物互作關(guān)系逐漸成為研究熱點。綠僵菌屬Metarhizium真菌是具有代表性的一類重要昆蟲病原真菌，其寄主包括8目200多種昆蟲和螨類，被研究作為害蟲生物防治劑，用于農(nóng)、林、草地蟲害的防控[1-2]。在草原上，應(yīng)用綠僵菌防治蝗蟲取得令人矚目的成效[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，施用的綠僵菌在田間土壤中有一定的腐生存活能力，從而保持較長的控害效果，馬鈴薯、花生等作物的根際環(huán)境有利于綠僵菌的宿存和增殖[6-8]。還有研究報道，一些綠僵菌種類或菌株對植物起到顯著的促生長作用。例如，綠僵菌處理番茄Lycopersicon esculentum后，植株株高、根長、側(cè)根數(shù)量和根干重都比對照明顯增加[9]。對柳枝稷Panicum virgatum、扁豆Phaseolus vulgaris、玉米Zea mays和花生Arachis hypogaea的研究也發(fā)現(xiàn)了綠僵菌促進植株生長的作用[10-12]，

研究者認為綠僵菌與植物存在根際互作和內(nèi)共生關(guān)系。然而，目前報道的綠僵菌宿主植物種類并不多，直接表明綠僵菌的植物內(nèi)生性實驗證據(jù)也很有限。Behie & Bidochka利用同位素15N跟蹤，證明了在昆蟲與植物（扁豆和柳枝稷）不接觸而羅伯茨綠僵菌Metarhizium robertsii存在的情形下，昆蟲的有機氮被轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，認為是昆蟲病原綠僵菌通過植物內(nèi)生作用將昆蟲15N攜帶傳送給植物[13]。后來，他們又以綠色熒光蛋白（GFP）標記的羅伯茨綠僵菌菌株接種扁豆，60 d后取根研磨并接種到選擇性培養(yǎng)基上，獲得了熒光菌落，以此證明了綠僵菌在植物根際定殖和內(nèi)生性[14]。

我們長期應(yīng)用綠僵菌防控草原蝗蟲，已取得良好防治效果，一些防控區(qū)域的蟲口密度持續(xù)控制在經(jīng)濟閾值以下[5，15]。為了研究應(yīng)用的綠僵菌在草原田間的存活動態(tài)和植物內(nèi)生性，我們構(gòu)建了增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記菌株，并將其用于內(nèi)蒙古錫林浩特草原，以兩種優(yōu)勢種牧草即羊草Leymus chinensis和克氏針茅Stipa krylovii進行試驗，以期了解綠僵菌在草原田間環(huán)境下的存活能力和種群動態(tài)。研究數(shù)據(jù)和結(jié)果將為充分利用綠僵菌的昆蟲病原性和植物內(nèi)生性，提高生物防治作用提供理論指導(dǎo)，也將成為綠僵菌物種生活方式多樣性、與植物互作及共進化研究的重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和分生孢子培養(yǎng)

金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae G-58為本實驗室構(gòu)建的攜帶增強型綠色熒光蛋白基因egfp的工程菌株。將菌株接種在添加0.5%酵母浸出粉的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDAY）平板上，在26℃下避光培養(yǎng)14 d，收集分生孢子，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試植物

供試植物為內(nèi)蒙古錫林浩特（東經(jīng)113°45′～114°21′、北緯42°15′～42°35′）田間多年生天然羊草Leymus chinensis和克氏針茅Stipa krylovii，沙質(zhì)土壤，肥力貧瘠。

1.3 綠僵菌接種植物處理和采樣

用滅菌的0.1%Tween-80水溶液配制綠僵菌G-58的分生孢子懸浮液。在顯微鏡下用血細胞計數(shù)器計數(shù)，得到濃度為1.35×107個/mL的孢子懸浮液。

在草原田間，分別選擇羊草和克氏針茅為單一優(yōu)勢種且植株長勢均勻地塊，扎下木樁標記樣方，每樣方1 m×1 m，內(nèi)含不少于30株植物。用打孔器在每株四周“十”字對稱打4個孔，孔距離植株2～3 cm、深10 cm。用注射器向每孔注入10 mL菌液（圖1）。每處理重復(fù)3個樣方，對照樣方注入清水。

處理當日和之后7、15、30、45、60 和75 d取樣。每次隨機取樣3株，用鏟子連根鏟出植株，連同泥沙帶回實驗室。輕輕抖動植株，去除外圍泥沙后，用毛筆小心清掃根表，收集根際土壤，保存于4℃，用于檢測土壤含菌量。另外，剪去植株地上莖葉部分，保留根系，用自來水和滅菌蒸餾水各漂洗2次，在超聲波清洗器（上海志信儀器有限公司，DL-120-B型）上清洗10 min（參考劉淑梅等[16]），再用滅菌蒸餾水漂洗2次，置于在吸水紙上自然晾干15 min。每個根分成兩份，一份在-80℃下保存，備用于PCR檢測，另一份保存于4℃，2 d內(nèi)進行內(nèi)生菌分離。

1.4 根際土壤中綠僵菌存活數(shù)量檢測

從每份根際土樣各稱取1.000 g，加滅菌的0.1%吐溫80水溶液9 mL，在旋渦振蕩器上振蕩30 s，2次，按1∶3稀釋1次，得到稀釋40倍的土壤懸浮液。從懸浮液中部吸取200 μL接種到選擇性培養(yǎng)基（1 000 mL PDAY中加氯霉素160 mg和放線菌酮80 mg）上，每個土樣重復(fù)接種5皿，涂布均勻。置于26℃培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落數(shù)。同時稱量土樣（精確至0.001 g）置于120℃烘烤120 min，檢測含水量。最終以菌落形成單位數(shù)cfus （colony forming units）即每g 干土壤的菌落數(shù)進行評估。

菌落形成單位數(shù)cfus=稀釋倍數(shù)×平皿菌落數(shù)/（1-含水量）。

1.5 根內(nèi)綠僵菌egfp標記PCR檢測

1.5.1 DNA提取

接種試驗菌株G-58于液體培養(yǎng)基（蔗糖3%，蛋白胨1%）中，26℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)60 h。用真菌DNA提取試劑盒（Genemark Biotech. Co.，Ltd）提取菌絲體DNA。羊草和克氏針茅根樣品用植物基因組DNA純化試劑盒（Genemark Biotech. Co.，Ltd）提取DNA。每份根樣品提取3份重復(fù)。提取的DNA樣品用分光光度計（IMPLEN公司NanoPhotmeter）測定濃度。

1.5.2 PCR條件和靈敏度

盡管PCR對特定的DNA模板敏感，但考慮到根中綠僵菌內(nèi)生量很低，大量的植物DNA可能會干擾引物靶向，因此，必須優(yōu)化PCR條件和提前檢測反應(yīng)靈敏度。根據(jù)供試菌株的egfp特定標記設(shè)計了引物擴增，經(jīng)檢測和優(yōu)化，得到引物對為Pg-F（5′-AGTCAGTCTCCCTTG CGGTT）和Pg-R （5′-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT）。設(shè)置1∶500，1∶1 000， 1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶3 500和1∶4 000系列比例的綠僵菌與羊草或克氏針茅的混合DNA模板。優(yōu)化的PCR體系為50 μL，其中包括5 μL 10×Ex Taq緩沖液，4 μL 2.5 mmol/L dNTP混合物，2 μL各10 μmol/L正反向引物，0.25 μL 5 U/μLEx Taq和1 μL DNA模板。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)程序為： 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min， 40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，保持在4℃。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5.3 根樣品egfp標記的特異性PCR檢測

采用上述優(yōu)化的PCR條件，檢測處理各采樣日的所有羊草和克氏針茅樣品，包括每個采樣日的3個植株根樣品的各3次重復(fù)提取的DNA。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。有陽性擴增片段的則確定為存在內(nèi)生的綠僵菌。

1.6 根內(nèi)生綠僵菌的分離培養(yǎng)鑒定

分離培養(yǎng)基（CAD）為1 000 mL PDAY中加氯霉素 160 mg、放線菌酮 80 mg和多果定20 mg。將上述 1.3 洗凈的根樣剪碎并略加研磨，涂布在 CAD平板上，26℃培養(yǎng) 5 d，將疑似菌落轉(zhuǎn)移到新PDAY平板上，再培養(yǎng) 10 d。通過菌落形態(tài)和顯微形態(tài)鑒定為綠僵菌后，再置于激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM） 488 nm波長下觀察，如果菌絲或孢子具有綠色熒光則判斷為供試綠僵菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌在根際存活的種群動態(tài)

通過選擇性培養(yǎng)基分離檢測土樣，得到施菌處理后75 d內(nèi)，綠僵菌在根際土壤中內(nèi)的存活數(shù)量動態(tài)（圖2），表明在干旱的內(nèi)蒙古草原，綠僵菌施用后種群數(shù)量快速下降，7、15和30 d時，在羊草根際分別下降至72.3%、26.4%和20.3%，在克氏針茅根際分別下降至18.8%、6.7%和5.8%； 之后繼續(xù)下降，但下降速率減緩，至75 d還有低密度種群延續(xù)宿存。相對地，羊草根際環(huán)境比克氏針茅更利于綠僵菌維持種群生存。

2.2 綠僵菌在根內(nèi)宿存的分子標記鑒定

2.2.1 PCR檢測根中綠僵菌egfp標記的靈敏性

在優(yōu)化的條件下，以1∶500～1∶4 000 之間8個比例的綠僵菌與羊草或克氏針茅混合DNA模板進行了PCR檢測，結(jié)果顯示，混合比低至1∶3 000的綠僵菌與羊草混合DNA和1∶3 500的綠僵菌與克氏針茅混合DNA都能夠被有效擴增，得到特異性egfp片段（圖3），說明優(yōu)化的PCR可以高靈敏地鑒定出宿存于羊草或克氏針茅根中的綠僵菌。

2.2.2 羊草、克氏針茅根內(nèi)生綠僵菌的PCR鑒定

對接種處理后不同時期的羊草、克氏針茅根樣本進行了PCR檢測，結(jié)果顯示，在羊草第7天、第15天的根和克氏針茅中第15天、第30天和第75天的根中擴增得到了egfp標記片段；但是并非3個重復(fù)植株全都能夠擴增得到預(yù)期片段（圖4）。因此可以確定施用的綠僵菌在約15 d后進入了羊草和克氏針茅根內(nèi)，但其宿存豐度較低且可能分布不均，導(dǎo)致有時根樣DNA的PCR不能檢測到egfp標記片段。

2.3 綠僵菌在根內(nèi)宿存的分離鑒定

在CAD分離培養(yǎng)基上，從處理的根培養(yǎng)得到形態(tài)類似綠僵菌的菌落，轉(zhuǎn)移到新PDAY上純化培養(yǎng)，經(jīng)顯微形態(tài)鑒定表明，從30、45 d和75 d根樣分離的菌落具有金龜子綠僵菌特征，進一步通過激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察，可見菌絲和孢子具有綠色熒光（圖5），即證明了綠僵菌的根內(nèi)宿存。

3 討論

現(xiàn)有的研究文獻多關(guān)注綠僵菌對昆蟲的致病作用，而對其與植物的關(guān)系和相互影響知之甚少。實際上，綠僵菌除了昆蟲致病性外，兼性腐生和植物內(nèi)生特性在植物保護中發(fā)揮著重要作用，應(yīng)當受到重視。

不同營養(yǎng)方式賦予了綠僵菌適應(yīng)不同環(huán)境的生存能力，包括侵染昆蟲實現(xiàn)種群大量增殖，利用土壤腐殖質(zhì)、植物根際游離碳延續(xù)種群，甚至進入植物組織內(nèi)部獲取生存機會。研究證明，昆蟲病原真菌能夠利用植物根際游離碳，并通過與根相互作用獲得生存和生長利益。例如，將綠僵菌施用到甘藍田間6個月后，在甘藍根際土壤（rhizosphere soil）中的存活數(shù)量比在根圍土壤（bulk soil）中高100倍，保持初始施菌105水平，認為根際因子對綠僵菌持續(xù)存活有促進作用[17]。還有試驗證明，綠僵菌施用1年后在歐洲云杉Picea abies根際的存活比在根圍存活更好[18]。綠僵菌在花生播種時施用后，其種群在根際與在遠離根土壤中的動態(tài)變化完全不同。雖然在90 d內(nèi)種群都下降至10%左右，然而120 d后，根際種群出現(xiàn)回升，達到初始接種量的50%～60%。作者分析認為是由于花生經(jīng)歷了較長時間發(fā)育，根代謝物分泌到根際環(huán)境，利于綠僵菌種群的重建[8]。因為花生如同一般植物，將從光合作用獲得的10%～40%的碳轉(zhuǎn)移到土壤中，形成分泌物、黏液、剝落的細胞和溶液[19-20]。根際環(huán)境可能是綠僵菌等昆蟲病原真菌離開昆蟲寄主后保持種群的重要庇護所，種群的延續(xù)是田間長期控制害蟲的必要前提。本試驗中，綠僵菌施用于干旱草原上，30 d內(nèi)也出現(xiàn)快速下降，然后降速減緩，至75 d時羊草和克氏針茅根際仍宿存有低密度種群，但未出現(xiàn)種群回升。根際種群能否繼續(xù)存活或增殖重建可能與植物發(fā)育代謝相關(guān)，還與溫濕度相關(guān)。在草原試驗區(qū)，氣候干熱，沙地持水力差，試驗期間監(jiān)測的土壤濕度日均都在5%以下，羊草和克氏針茅正常生長但不旺盛，這些條件可能不足以促進根際綠僵菌種群的重建。

近年發(fā)現(xiàn)綠僵菌植物內(nèi)生性并引起關(guān)注，但當前研究仍然較少，尚未揭示其相互作用機制。檢測證明綠僵菌與宿主植物內(nèi)生關(guān)系是相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。從當前的研究看，僅報道了少數(shù)宿主植物種類的生長促進作用，更少報道綠僵菌植物內(nèi)生性的直接證明。Sasan等以綠色熒光蛋白（GFP）標記的羅伯茨綠僵菌菌株接種柳枝稷，卻只在用乳酸苯酚-棉藍染色的接種60 d后的根組織縱切片中觀察到皮層細胞間隙內(nèi)存在菌絲體，沒有切片觀察的熒光菌絲[10]。Behie等也以綠色熒光蛋白（GFP）標記的羅伯茨綠僵菌菌株接種扁豆，60 d后取根研磨并接種到選擇性培養(yǎng)基上，獲得了熒光菌落，以此證明了綠僵菌的植物定植和內(nèi)生性[14]?？梢姡G僵菌在植物中宿存幾率或宿存量可能很小，不像觀察植物病原菌和專性共生菌那樣可直接觀察和捕捉到內(nèi)生證據(jù)。分子生物學(xué)方法，如特異基因標記片段的PCR，可能在檢測綠僵菌植物內(nèi)生性中具有高靈敏優(yōu)勢。本試驗中，我們以增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的綠僵菌接種羊草和克氏針茅，對不同采樣時間的根樣也通過激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）進行了觀察，但很遺憾沒有觀察到根組織中有清晰的熒光菌絲或孢子。然而，通過對egfp特異標記片段的PCR，在幾個時間段采集的樣本中都證明了施用的綠僵菌存在于羊草和克氏針茅根中。從系列比例混合的綠僵菌-根DNA模板試驗證明PCR檢測靈敏度可達到1∶3 000，可作為低量宿存菌的快速高效檢測方法。

綠僵菌與昆蟲、植物在相同棲境中長期共存，它們形成了復(fù)雜的相互關(guān)系，演變出不同的生態(tài)功能以彼此相適應(yīng)。本研究支持綠僵菌物種的多功能生活方式，對研究植物與真菌之間的相互作用和共同進化具有重要意義。因此需要進一步研究綠僵菌在田間種群動態(tài)變化規(guī)律和綠僵菌內(nèi)生的形成機制及其生物學(xué)意義，評估綠僵菌的多重生態(tài)功能在植物保護實踐中的潛力。

參考文獻

[1] SKINNER M， PARKER B L， KIM J S.Role of entomopathogenic fungi in integrated pest management [M]∥ABROL D P， SHANKAR U. Integrated pest management. Wallingford， UK： CABI Publishing， 2014： 169-191.

[2] 張禮生，張澤華，高松，等.綠僵菌生物農(nóng)藥的研制與應(yīng)用[J].中國生物防治，2006，22（S1）：141-146.

[3] BATEMAN R， JENKINS N， KOOYMAN C， et al. The development of an acridid-specific mycoinsecticide [M]∥LACE L A.Microbial Control of Insect & Mite Pests，chap.23 LUBILOSA，2017：343-353.

[4] 孫濤，龍瑞軍.我國草原蝗蟲生物防治技術(shù)及研究進展[J].中國草地學(xué)報，2008，30（3）：88-93.

[5] 張澤華，高松，張剛應(yīng)，等.應(yīng)用綠僵菌油劑防治內(nèi)蒙草原蝗蟲的效果[J].中國生物防治，2000，16（2）：49-52.

[6] PAULITZ T C. Population dynamics of biocontrol agents and pathogens in soils and rhizospheres[J]. European Journal of Plant Pathology， 2000， 106：401-413.

[7] 陳斌，鄧裕亮，李正躍，等.綠僵菌對小云斑鰓金龜毒力及在土壤中的宿存[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，26（5）：580-583，593.

[8] LIU Xun， NONG Xiangqun， WANG Qinglei， et al. Persistence and proliferation of a ChineseMetarhizium anisopliae s.s. isolate in the peanut plant root zone [J]. Biocontrol Science and Technology， 2016， 26（6）： 746-758.

[9] ELENA G， BEATRIZ P， ALEJANDRO P， et al.Metarhizium anisopliae（Metschnikoff） Sorokin promotes growth and has endophytic activity in tomato plants [J]. Advances in Biological Research， 2011， 5（1）： 22-27.

[10]SASAN R K， BIDOCHKA M J. The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii （Clavicipitaceae） is also an endophyte that stimulates plant root development[J]. American Journal of Botany， 2012， 99（1）： 101-107.

[11]KABALUK J T， ERICSSON J D. Seed treatment increases yield of field corn when applied for wireworm control [J]. Agronomy Journal， 2007， 99： 1377-1381.

[12]LIU Shaofang， WANG Guangjun， NONG Xiangqun， et al. EntomopathogenMetarhizium anisopliae promotes the early development of peanut root [J].Plant Protection Science，2017，53（1）：8-14.

[13]BEHIE S， BIDOCHKA M. Endophytic insect-parasitic fungi translocate nitrogen directly from insects to plants[J]. Science，2012， 336（6088）： 1576-1577.

[14]BEHIE S W， JONES S J， BIDOCHKA M J. Plant tissue localization of the endophytic insect pathogenic fungiMetarhizium and Beauveria [J].Fungal Ecology， 2015， 13： 112-119.

[15]王潔，涂雄兵，范要麗，等.綠僵菌在蝗蟲種群中傳播流行與其持續(xù)控制作用[J].草業(yè)與畜牧，2015（3）：34-41.

[16]劉淑梅，陳軍.根類中草藥凈洗中引進超聲波清洗技術(shù)的探討[J].甘肅高師學(xué)報，2012，41（3）：167-168.

[17]HU Gang， ST LEGER R J. Field studies using a recombinant mycoinsecticide （Metarhizium anisopliae） reveal that it is rhizosphere competent [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（12）： 6383-6387.

[18]BRUCK D J. Ecology ofMetarhizium anisopliae in soilless potting media and the rhizosphere： implications for pest management [J]. Biological Control， 2005， 32： 155-163.

[19]ANDREWS J H， HARRIS R F. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces [J]. Annual Review of Phytopathology， 2000， 38： 145-180.

[20]BARDGETT R D. The biology of soil： A community and ecosystem approach [M]. New York： Oxford University Press， 2005： 86-118.

（責任編輯：田 喆）