李星，陳默，柴團耀，王紅

1中國科學院大學，北京 100049

2中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101

聚酮類化合物 (Polyketides)是一大類在植物、微生物中廣泛存在的結構復雜、功能多樣的天然產(chǎn)物，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和免疫抑制等藥理活性。聚酮類化合物雖然種類繁多、結構復雜，但其在生物體內(nèi)具有共同的合成機制，聚酮合酶 (Polyketide synthases，PKSs)是催化聚酮類化合物合成的關鍵酶。根據(jù)PKSs酶系的結構，可將其分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PKSs。其中，Ⅰ型PKSs多存在于細菌和真菌中，是一類以模塊形式存在的多功能酶，每一模塊含有一套獨特的、非重復使用的催化功能域[1]。Ⅱ型PKSs存在于土壤微生物中，是一個多功能酶復合體，只包含一套可重復使用的結構域。Ⅲ型PKSs即查爾酮合酶超家族 (Chalcone synthase superfamily,CHS superfamily)，主要分布在植物界，近年來在細菌和真菌中也鑒定了多種Ⅲ型PKSs[2]。植物Ⅲ型PKSs與Ⅰ型和Ⅱ型PKSs相比結構簡單，由40?45 kDa的同源二聚體組成，每個亞基的活性中心具有多種活性，能夠完成底物加載、聚酮鏈延伸、特定的環(huán)化和產(chǎn)物的釋放。

植物Ⅲ型PKSs催化形成一系列結構迥異、生理活性不同的聚酮類化合物的骨架結構，包括查爾酮 (Chalcone)、二苯乙烯 (Stilbene)、間苯三酚 (Phloroglucinol)、間苯二酚 (Resorcinol)、萘(Naphthalene)、吖啶酮 (Acridone)、吡喃酮(Pyrone)、聯(lián)芐 (Bibenzyl)、苯亞甲基丙酮(Benzalacetone)、二苯甲酮 (Benzophenone)、色原酮 (Chromone)、聯(lián)苯 (Biphenyl)、喹諾酮(Quinolinone)、姜黃素 (Curcuminoid)、異香豆素(Isocoumarin)、芪-羧酸酯 (Stilbenecarboxylate)等[3-4]。植物Ⅲ型PKSs的功能多樣性主要體現(xiàn)在對起始底物的選擇性、縮合反應次數(shù) (聚酮鏈延伸的長度)以及產(chǎn)物的不同環(huán)化方式等[5]。植物Ⅲ型PKSs可以利用多種酰基輔酶A(Coenzyme A,CoA)作為起始底物，包括脂肪族?；鵆oA和芳香族?；鵆oA，從較小的乙酰CoA到較大的N-甲基鄰氨基苯甲酰-CoA(N-methylanthraniloyl-CoA)，從極性的丙二酰CoA到非極性的N-己酰CoA均可以作為其底物。盡管多數(shù)植物Ⅲ型PKSs催化3次縮合反應，但不同的植物Ⅲ型PKSs催化的縮合反應次數(shù)可以從1次到8次不等。植物Ⅲ型PKSs催化產(chǎn)物環(huán)化反應的方式主要包括：C6?C1 Claisen型環(huán)化 (Claisen-type cyclization)，如查爾酮合酶 (Chalcone synthase,CHS)、吖啶酮合酶(Acridone synthase,ACS)、苯戊酮合酶 (Valerophenone synthase,VPS)、二苯甲酮合酶 (Benzophenone synthase,BPS)；C2?C7 Aldol型環(huán)化 (Aldol-type cyclization)，如芪合酶 (Stilbene synthase,STS)、二羥基戊苯合酶 (Olivetol synthase,OLS)；內(nèi)酯化(Lactonization)，如 2-吡喃酮合酶 (2-Pyrone synthase,2-PS)。另外，還有一些植物Ⅲ型PKSs產(chǎn)物不經(jīng)過環(huán)化，如苯亞甲基丙酮合酶 (Benzalacetone synthase,BAS)和姜黃素合酶 (Curcuminoid synthase,CUS)[3](圖1)。正是由于植物Ⅲ型PKSs起始底物的特異性、縮合反應次數(shù)以及產(chǎn)物環(huán)化方式三個方面的不同決定了植物聚酮類化合物的數(shù)量、結構以及生理活性的多樣性[3,5]。

圖1 植物Ⅲ型PKSs所催化的反應及產(chǎn)物 (環(huán)化反應類型及位置在圖中標出)Fig.1 Typical enzyme reactions catalyzed by plant type III PKSs(The position and type of cyclization reaction of the presumed linear polyketide intermediate are depicted).ACS:acridone synthase;BAS:benzalacetone synthase;CHS:chalcone synthase;2-PS:2-pyrone synthase;STS:stilbene synthase.

紫花苜蓿CHS(Medicago sativaCHS,MsCHS)等植物Ⅲ型PKSs晶體結構的解析和定點突變研究表明，植物Ⅲ型PKSs家族成員具有相似的三維結構和催化機制[6-8]。Cys164、His303和Asn336(以MsCHS氨基酸序列編號，以下未特別說明均按此編號)3個位點的氨基酸殘基在已發(fā)現(xiàn)的植 物Ⅲ型PKSs中高度保守，它們組成酶活性中心催化三聯(lián)體 (Catalytic triad)。其中Cys164是聚酮鏈形成過程中的親核活性位點，通過共價鍵與起始底物分子和反應中間體結合，而His303和Asn336則起著穩(wěn)定或活化起始底物和延伸底物的作用。植物Ⅲ型PKSs的催化機制為：1)起始底物-CoA加載到酶活性中心Cys164的SH基團；2)延伸底物丙二酰CoA脫羧形成乙酰CoA；3)聚酮鏈開始延伸；4)聚酮中間體-酶復合物完成環(huán)化和芳構化[7]。MsCHS晶體結構的解析鑒定了位于活性腔內(nèi)對起始底物的選擇性和聚酮鏈的延伸長度具有決定作用的多個氨基酸殘基，包括Thr132、Ser133、Thr194、Thr197、Gly256、Phe265和Ser338，這些氨基酸殘基在CHS中保守，但在其他Ⅲ型PKSs中被相應的氨基酸替代，正是由于特定位置上這些重要氨基酸的替換決定了不同的植物Ⅲ型PKSs對起始底物的選擇性和聚酮鏈延伸長度的不同，從而形成不同的產(chǎn)物[7-8]。

定點突變技術是研究蛋白質(zhì)結構與功能之間復雜關系的重要工具，近年來隨著不同的植物Ⅲ型PKSs基因的克隆和鑒定，人們通過定點突變技術對各種可能影響Ⅲ型PKSs所催化反應 (如控制聚酮鏈長、催化腔大小和環(huán)化機制)的氨基酸殘基進行了定點突變研究以揭示這類酶的結構與功能的關系。本文將綜述近年來基于定點突變技術的植物Ⅲ型PKSs結構與功能關系的研究進展。

1 已鑒定的植物Ⅲ型PKSs

植物Ⅲ型PKSs家族中，發(fā)現(xiàn)最早、分布最廣泛、研究最為透徹的是查爾酮合酶CHS。1983年，Reimold等從歐芹Petroselinum hortense的培養(yǎng)細胞中克隆了第一個植物Ⅲ型PKSs家族成員——查爾酮合酶基因[9]，目前已從苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中克隆到大量的CHS基因。該酶是類黃酮類化合物生物合成途徑的關鍵酶，它催化來自丙二酰輔酶A(Ⅲ型PKSs的延伸底物)的3個乙?；鶊F通過連續(xù)3步縮合反應連接到4-香豆酰輔酶A(Ⅲ型PKSs的起始底物)分子上，形成四酮(Tetraketide)中間體，之后通過克萊森型 (Claisen type)環(huán)化反應生成芳香族聚酮化合物柚皮素查爾酮 (Naringenin chalcone)——類黃酮類化合物生物合成的前體。芪合酶STS是另一個被廣泛研究的植物Ⅲ型PKSs家族成員，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該基因是植物在進化過程中由CHS進化來的，不同植物中二者之間具有65%以上的氨基酸序列同源性。1988年，Schr?der等首次從花生Arachis hypogaea培養(yǎng)細胞中克隆了STS基因[10]，目前已從被子植物、裸子植物、蕨類植物中克隆到多個STS基因[11]。STS利用與CHS相同的起始底物4-香豆酰CoA，催化3分子丙二酰CoA縮合形成與CHS相同的四酮中間體，但隨后二者的環(huán)化方式不同，STS催化四酮中間體通過分子內(nèi)C2?C7 Aldol型縮合形成白藜蘆醇，其中C1以CO2形式被脫去。與植物中普遍存在的CHS不同，STS只存在于能夠產(chǎn)生白藜蘆醇的植物中。

除了CHS和STS，植物中已鑒定的Ⅲ型PKSs還包括聯(lián)芐合酶 (Bibenzyl synthase,BBS)[12]、2-PS[13]、C-methylchalcone synthase(PstrCHS2)[14]、VPS[15]、p-Coumaroyltriacetic acid synthase,CTAS)[16]、ACS[17]、BAS[18]、BPS[19]、Stilbenecarboxylate synthase(STCS)[20]、蘆薈松合酶 (Aloesone synthase,ALS)[21]、聚五酮色原酮合酶 (Pentaketide chromone synthase,PCS)[22]、聚八酮合酶 (Octaketide synthase,OKS)[23]、聯(lián)苯合酶 (Biphenyl synthase,BIS)[24]、CUS[25]、聚六酮合酶 (Hexaketide synthase,HKS)[26-27]、Isobutyrophenone synthase(BUS)[28]、OLS[29]、喹諾酮合酶 (Quinolone synthase,QNS)[30]、5-甲基間苯二酚合酶 (Orcinol synthase,ORS)[31]、烷基乙酮CoA合酶 (Alkyldiketide-CoA synthase,ADS)和烷基喹諾酮合酶 (Alkylquinolone synthase,AQS)[32]等。不同的植物Ⅲ型PKSs之間的差別主要體現(xiàn)在起始底物的特異性、縮合反應次數(shù) (聚酮鏈延伸的長度)以及產(chǎn)物合成所采取的不同環(huán)化方式等[5]?，F(xiàn)在一般認為植物PKSs起源于脂肪酸合酶 (Fatty acid synthases,FASs)系統(tǒng)，由具有類似結構的KSⅢ (Ketoacyl synthaseⅢ)進化而來，后者與現(xiàn)在的PKSs具有相似的三級結構和底物結合位點[5]。

2 植物Ⅲ型PKSs序列分析

隨著越來越多的植物Ⅲ型PKSs被鑒定，序列分析表明，植物Ⅲ型PKSs之間氨基酸序列相似性在60%?75%以上，都編碼約400個氨基酸的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)通常以同源二聚體的形式存在和發(fā)揮功能[3]。查爾酮合酶基因在裸子植物和被子植物中大多以多個拷貝存在，同時，由于查爾酮合酶基因和其他植物Ⅲ型聚酮合酶基因的核苷酸序列具有很高的一致性和相似性，這意味著很可能現(xiàn)在的植物Ⅲ型聚酮合酶家族基因是由查爾酮合酶基因經(jīng)過基因的復制和變異進化而來的[33]。

本文所涉及的植物Ⅲ型PKSs的氨基酸序列比對結果見圖2。從圖中可以看出，組成酶活性中心催化三聯(lián)體的3個氨基酸殘基Cys164、His303和Asn336在所有已發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型PKSs中絕對保守；起到“Gatekeeper”作用的2個氨基酸殘基Phe215和Phe265，具有調(diào)節(jié)活性腔與CoA結合通道之間的空間結構的功能，這2個氨基酸殘基在大多數(shù)PKSs中高度保守，但在有些PKSs中被其他氨基酸所替換，如掌葉大黃Rheum palmatum的BAS中Phe215被Leu替代[18]，虎杖Polygonum cuspidatum的PcPKS2(功能上是1個BAS)中，Phe215和Phe265分別被Leu和Cys取代[34](圖2)。另外，位于活性中心腔內(nèi)的多個氨基酸殘基，包括 Thr132、Ser133、Thr194、Thr197、Gly256、Phe265和Ser338，被認為對聚酮鏈的延伸長度以及對起始底物和產(chǎn)物的特異性具有決定作用。這些氨基酸殘基在CHS中保守，而在其他不同功能Ⅲ型PKSs中則被相應的氨基酸替代 (圖2)。因此，這些氨基酸殘基通常是研究Ⅲ型PKSs結構與功能關系、基于結構的Ⅲ型PKSs分子定向改造的重要靶點。

圖2 植物Ⅲ型PKSs家族成員氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of plant type III PKSs.The catalytic triad(Cys164,His303,Asn336)are marked with dots.The two gatekeepers(Phe 215 and Phe 265)are marked with triangles.The critical residues lining the active-site cavity(Thr132,Ser133,Thr197,Gly256 and Ser 338)are marked with squares(numbering in MsCHS).PsSTS:Pinus sylvestris stilbene synthase;MsCHS:Medicago sativa chalcone synthase;GH2PS:Gerbera hybrid 2-pyrone synthase;AaOKS:Aloe arborescens octaketide synthase;AaPCS:A.arborescens pentaketide chromone synthase;HaBPS:Hypericum androsaemum benzophenone synthase;RpALS:Rheum palmatum loesone synthase;RpBAS:R.palmatum bezalacetone synthase;RgACS:Ruta graveolens acridone synthase;AmQNS:Aegle marmelos quinolone synthase;ErADS:Evodia rutaecarpa alkyldiketide-CoA synthase;ErAQS:E.rutaecarpa alkylquinolone synthase.

3 利用定點突變研究植物Ⅲ型PKSs結構與功能的關系

3.1 2-吡喃酮合酶

2-吡喃酮合酶2-PS催化起始底物乙酰CoA和2分子丙二酰CoA縮合形成吡喃酮。2000年，Jez等解析了非洲菊Gerbera hybrid2-PS-乙酰乙酰CoA復合物2.05 ?的晶體結構。結果表明，非洲菊2-PS與MsCHS具有相似的三維折疊、相同的催化殘基和高度保守的CoA結合位點[8]。進一步的結構解析顯示，MsCHS中位于活性腔的Thr197、Ile254、Gly256和Ser338在非洲菊2-PS中分別被Leu、Met、Leu和Ile替代，這4個氨基酸的替代使得非洲菊2-PS催化腔的體積只有MsCHS的1/3，因此只能利用比4-香豆酰CoA側鏈基團更小的乙酰CoA作為起始底物，催化2個乙?；鶊F通過連續(xù)的縮合反應連接到乙酰CoA上，之后由內(nèi)酯化反應生成6-甲基-4-羥基-2-吡喃酮 (6-Methyl-4-hydroxy-2-pyrone)。作者隨后進行的定點突變研究表明，將MsCHS的197位、256位和338位3個位點的氨基酸同時突變?yōu)榉侵蘧?-PS相對應的氨基酸后，由于T197L/G256L/S338I突變后各氨基酸殘基的側鏈基團較野生型變大，使得突變體不能接受4-香豆酰CoA為起始底物，而是以乙酰CoA為起始底物與2分子丙二酰CoA縮合形成較查爾酮分子量更小的吡喃酮，在功能上已完全轉變?yōu)?個2-PS(表1)，這也是首次實現(xiàn)對植物Ⅲ型PKS的定向改造[8]。他們結合晶體結構信息進一步證明，MsCHS這3個氨基酸殘基的突變使其催化腔體積變小，從而影響了酶對起始底物分子的選擇和聚合反應的次數(shù)，從而最終決定了產(chǎn)物分子的大小?；谏鲜鼋Y果，Jez等提出了空間模型理論 (Steric modulation)來解釋Ⅲ型PKS家族蛋白底物和反應類型的多樣性。該模型認為，Ⅲ型PKSs活性口袋空間的大小決定了它們起始底物的大小和聚酮產(chǎn)物延伸的長度。非洲菊2-PS的活性口袋大小只有MsCHS的1/3，所以更適合接受乙酰輔酶A這種側鏈基團較小的底物[8]。此外，Abe等 (2005)同源建模的結果表明，能夠催化乙酰CoA與丙二酰CoA進行8次聚合反應的木立蘆薈Aloe arborescens的OKS，其催化口袋的體積確實要比僅能催化3次聚合反應的MsCHS更大，這也是空間模型理論的證據(jù)之一[23]。

3.2 吖啶酮合酶

吖啶酮合酶ACS催化起始底物N-甲基鄰氨基苯甲酰-CoA和3分子丙二酰CoA縮合形成吖啶酮。根據(jù)蕓香Ruta graveolens的2個ACS(ACS1、ACS2)與MsCHS序列比對和同源建模分析結果，Luka?in等推測蕓香ACS2的Ser132、Ala133和Val265三個氨基酸殘基 (MsCHS中分別為Thr132、Ser133和Phe265，以MsCHS氨基酸序列編號)可能對其底物選擇特異性具有重要作用。隨后蕓香ACS2定點突變結果表明，V265F突變體的活性只有野生型的75%，而且突變體明顯地優(yōu)先選擇4-香豆酰CoA為其底物，而ACS2(S132T/A133S/V265F)三突變體在功能上已完全轉變?yōu)镃HS(仍具有較弱的ACS活性)(表1)。該研究結果也表明，ACS是由CHS通過少數(shù)幾個氨基酸的替換進化而來的[35]。

表1 植物Ⅲ型PKSs定點突變后底物、產(chǎn)物及功能的比較Table 1 Comparison of plant type III PKSs in substrates,products and functions after site-directed mutagenesis

3.3 查爾酮合酶

Gly256位于CHS催化腔的表面，與延伸的聚酮鏈直接接觸，因此該位點被認為是研究催化腔體積與Ⅲ型PKSs聚酮鏈長度相關性的理想靶點。Jez等對MsCHS2的Gly256進行了一系列定點突變 (G256A、G256V、G256L、G256F)，其結果表明，當以4-香豆酰CoA為底物時，G256A和G256V突變體中四酮內(nèi)酯 (Tetraketide lactone)的合成量較野生型明顯增加；G256L和G256F突變體中催化腔的體積進一步受到限制，此時苯乙烯基吡喃酮產(chǎn)物BNY(bis-Noryangonin)的合成量明顯增加 (表1)。進一步的X-衍射晶體結構分析表明，第256位氨基酸側鏈的大小既影響聚合反應的次數(shù)，也影響聚酮中間體的構象。據(jù)此他們認為在Ⅲ型PKS家族中，第256位氨基酸的特異性進化可能是在不破壞酶的催化活力的前提下快速實現(xiàn)產(chǎn)物多樣性的一個重要因素[36]。

2002年，Jez等推測MsCHS活性位點入口處的 2個被稱為“Gatekeepers”的苯丙氨酸殘基(Phe215與Phe265)很可能與酶對起始底物特異性選擇有關。他們對這2個位點進行了一系列的定點突變，隨后體外添加不同性質(zhì)和大小的CoA硫酯作為測試底物，在檢測了突變蛋白對不同底物的利用情況后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)215S突變蛋白能利用一種野生型CHS蛋白原本并不能接受的N-甲基鄰氨基苯甲酰-CoA(N-methylanthraniloyl-CoA)作為其底物，催化產(chǎn)生一種新的生物堿類化合物(N-methylanthraniloyltriacetic acid lactone)(表 1)[37]。這一研究結果表明，單一位點的氨基酸殘基突變后可以改變酶對底物的選擇性，這也是一個通過體外改造植物Ⅲ型PKS使之合成新的次生代謝物的成功實例。

2006年，Abe實驗室根據(jù)黃芩Scutellaria baicalensisSbCHS與木立蘆薈OKS活性位點(197、256、338)氨基酸序列的差異，對SbCHS的Thr197、Gly256、Ser338進行了一系列的單突變、雙突變和三突變研究，發(fā)現(xiàn)在以丙二酰CoA為底物時 (缺乏4-香豆酰CoA)，SbCHS及其突變體均能催化丙二酰CoA脫羧縮合，但聚酮鏈延伸在三酮階段終止，形成三乙酸內(nèi)酯 (Triacetic acid lactone，TAL)為主產(chǎn)物，這與MsCHS的T197L、G256L、S338I單突變體形成TAL的報道一致[8,38]。另外，通過對SbCHS S338V酶促反應產(chǎn)物的仔細檢測發(fā)現(xiàn)，該突變體除了形成TAL外，還產(chǎn)生微量的八酮產(chǎn)物SEK4和SEK4b，而且在SbCHS (T197G/G256L/S338V)突變體 (該突變體在功能上類似OKS)中形成SEK4/SEK4b的活性明顯增加 (表1)。作者推測SbCHS S338V催化的機制是由于S338V突變?yōu)榫弁虚g體延伸至埋藏于野生型CHS中的1個額外的口袋提供了空間引導，進而導致形成較長的聚酮鏈[38]。該研究表明，植物中普遍存在的CHS可以通過對其單一活性位點的修飾 (S338V)而使其產(chǎn)生八酮化合物SEK4/SEK4b，該位點的重要性也被其他植物Ⅲ型PKSs的定點突變研究所證實。如掌葉大黃ALS T338S突變體喪失了ALS活性[39]，而該植物的BAS S338V突變體的BAS活性增加了2倍[40-41]。

2007年，Wanibuchi等從苔蘚植物蛇足石杉Huperzia serrata中鑒定了一個多功能的Ⅲ型聚酮合酶HsPKS1，在體外酶促反應中，該酶可以催化形成多種芳香類四酮產(chǎn)物，包括柚皮素查爾酮、二苯甲酮、間苯三酚和吖啶酮。有趣的是，HsPKS1還可以利用一些CHS不能利用的較大的起始底物，如4-甲氧基肉桂酰-CoA(4-methoxycinnamoyl-CoA)和N-甲基鄰氨基苯甲酰-CoA，與3分子丙二酰CoA 縮合形成 4-methoxy-2’,4’,6’-trihydroxychalcone和1,3-dihydroxy-N-methylacridone，表明該酶具有1個較大的底物結合腔[42]。進一步的定點突變研究表明，HsPKS1 S348G突變 (對應MsCHS Ser338)使突變體中活性腔的體積擴展，不僅使聚酮鏈延伸的長度增加，而且環(huán)化機制也發(fā)生了改變，從而可以催化起始底物2-氨甲?；郊柞oA(2-Carbamoylbenzoyl-CoA)與3分子丙二酰CoA縮合形成一種新穎的聚酮-生物堿類骨架Dibenzoazepine，表明通過對Ⅲ型PKSs的定向改造，可以合成自然界不存在的具有活性的復雜化合物[43]。

近年來，本實驗室從藥用植物虎杖中克隆到多個植物Ⅲ型 PKS基因，包括PcPKS1[44]、PcPKS2[34]、PcCHS、PcSTS[45]和PcCHS1[46]等。其中PcCHS1是1個典型的查爾酮合酶，在pH 7?8時能高效地催化合成查爾酮作為單一產(chǎn)物，在pH 9時，除合成查爾酮之外，還能合成一定量的苯亞甲基丙酮[46]。對PcCHS1進行了一系列定點突變研究后發(fā)現(xiàn)，一些位于非活性位點甚至處在酶蛋白表面的氨基酸殘基不僅具有維持蛋白結構的作用，還直接參與對酶活性的調(diào)控。例如，當PcCHS1第82位的Gln突變?yōu)镻ro后，Q82P突變蛋白的查爾酮合成活性較野生型降低，且在pH 9時不能合成BA；當?shù)?98位的Cys突變?yōu)镻he后，C198F突變蛋白幾乎完全失去活性；但是，Q82P/C198F雙突變酶蛋白卻能在pH 8–9時恢復較高的BA合成活性，而且在pH 9時，該雙突變蛋白還能較大量地催化合成許多CHS常見的2種脫軌產(chǎn)物CTAL(4-Coumaroyltriacetic acid lactone)和BNY；此外，當PcCHS1第105位的Arg突變?yōu)镚ln后，R105Q突變蛋白改變了野生型蛋白BA合成活性對pH值的依賴性。這些結果表明，遠離活性中心甚至是處在酶蛋白表面的氨基酸殘基也可能對Ⅲ型PKS的結構與催化活性產(chǎn)生直接的影響[47]。

Fukuma等通過對葛根Pueraria lobataCHS位于酶蛋白表面保守的精氨酸殘基 (Arg68、Arg172、Arg199、Arg328和Arg350)的系列定點突變研究表明，Arg199和Arg350對維持酶蛋白結構的完整性和酶蛋白的可折疊性具有重要作用，而Arg68、Arg172和Arg326則通過與其他保守氨基酸殘基的互作協(xié)助其催化腔的精確定位及維持活性位點的正確拓撲結構，該研究也表明遠離活性中心的一些氨基酸殘基對酶蛋白的催化活性具有重要影響[48]。

3.4 聚五酮色酮合酶和聚八酮合酶

木立蘆薈的聚五酮色酮合酶PCS催化5分子丙二酰CoA通過分子間連續(xù)4步縮合反應形成五酮產(chǎn)物5,7-Dihydroxy-2-methylchromone[22]，而來自同一植物的聚八酮合酶OKS則催化8分子丙二酰CoA通過分子間連續(xù)7步縮合反應形成八酮產(chǎn)物SEK4和SEK4b[23]。序列比對結果顯示，二者的氨基酸序列具有91%的一致性，MsCHS活性腔保守的3個氨基酸Thr197、Gly256和Ser338在木立蘆薈PCS中分別被Met、Leu、Val替換，而在OKS則分別被Gly、Leu、Thr替換[22-23]。定點突變研究顯示，將木立蘆薈PCS中207位的Met突變?yōu)镺KS中對應的Gly后 (對應MsCHS Thr197)，PCS M207G突變體在功能上轉變?yōu)镺KS，即催化8分子丙二酰CoA縮合形成八酮產(chǎn)物 SEK4和 SEK4b(表 1)[22]。而 OKS中 G207由小到大的系列突變 (G207A、G207T、G207M、G207L、G207F和G207W)結果顯示，雖然所有突變體均喪失了OKS活性，但突變體獲得了形成較短的聚酮鏈產(chǎn)物的活性 (根據(jù)側鏈大小不同，可以形成從三酮到七酮大小不同的聚酮化合物)，其中OKS G207M突變體 (將OKS中207位的Gly突變?yōu)镻CS中對應的Met)在功能上轉變PCS(表1)[23]。上述結果也被RpALS A197T和A197G突變體分別催化形成五酮產(chǎn)物和八酮產(chǎn)物的報道所證實[39]。這些研究結果清楚地表明，207位氨基酸殘基 (對應MsCHS Thr197)控制著聚酮鏈延伸的長度及產(chǎn)物的特異性，暗示Ⅲ型PKSs的功能多樣性可以通過單一位點氨基酸殘基的替換進化而來。

3.5 蘆薈松合酶

掌葉大黃的蘆薈松合酶RpALS催化乙酰CoA為起始底物與6分子丙二酰CoA脫羧縮合形成七酮化合物蘆薈松 (Aloesone)。序列比對顯示，MsCHS活性腔中保守的3個氨基酸殘基Thr197、Gly256、Ser338在 RpALS中分別被 Ala197、Leu256、Thr338替換[21]。同源建模預測，RpALS中這3個氨基酸殘基的替換使得其活性腔的結構更適合利用較4-香豆酰CoA更小的乙酰CoA作為起始底物，從而為合成較CHS更長的聚酮鏈提供了足夠的空間，使得最終形成七酮產(chǎn)物蘆薈松[39]。定點突變研究表明，將RpALS上述3個位點的氨基酸殘基分別突變?yōu)镸sCHS對應的氨基酸后，3個突變體 (A197T、L256G、T338S)均完全喪失了原來的七酮合成活性。其中，A197T突變體形成五酮產(chǎn)物2,7-dihydroxy-5-methylchromone，而L256G和T338S僅能形成三酮產(chǎn)物TAL(表1)。進一步定點突變的結果表明，L256G突變體能夠接受原來野生型RpALS不能接受的4-香豆酰CoA為起始底物，表明ALS中第256位氨基酸殘基控制著酶對底物的選擇性。A197T突變體能夠高效催化乙酰CoA與4分子丙二酰CoA縮合形成五酮產(chǎn)物2,7-dihydroxy-5-methylchromone，而A197G突變體則形成八酮產(chǎn)物SEK4和SEK4b，表明ALS中第197位氨基酸殘基控制著聚酮鏈延伸的長度，與木立蘆薈PCS和OKS中197位氨基酸殘基控制聚酮鏈長度的結果相吻合[22-23]。RpALS中338位Thr靠近催化位點Cys164，對聚酮中間體進入活性腔提供了空間引導，進而導致七酮的形成。另外，RpALS(A197T/L256G/T338S)三突變體在功能上已轉變?yōu)?個四酮合酶，該酶利用4-香豆酰CoA為起始底物，形成四酮產(chǎn)物CTAL[39]。

3.6 芪合酶

芪合酶STS利用與CHS相同的底物 (4-香豆酰CoA和丙二酰CoA)形成相同的四酮中間體。隨后，二者通過不同的機制進行環(huán)化，STS催化四酮中間體通過分子內(nèi)C2?C7 Aldol型縮合，同時以CO2形式脫去C1形成白藜蘆醇；而CHS則催化四酮中間體通過分子內(nèi)C6?C1 Claisen型縮合形成柚皮素查爾酮。

2004年，Austin等報道了歐洲赤松Pinus sylvestrisSTS 2.1 ?的晶體結構。結構解析顯示，歐洲赤松STS與MsCHS活性腔的拓撲結構僅存在細微的差異，但這些細微的差異不足以導致這兩種酶催化相同的四酮中間體進行不同的環(huán)化反應。通過對二者晶體結構的仔細比對發(fā)現(xiàn)，STS活性位點132–136殘基之間一個環(huán)的構象明顯改變，使得該處的Thr132殘基發(fā)生了細微的位移，從而使其側鏈羥基能夠與緊鄰催化活性腔Cys的Ser338-stabilized水分子形成氫鍵。由于Thr132在Ⅲ型PKSs中高度保守，STS中其位置的移動明顯地影響催化活性腔Cys164周圍的氫鍵網(wǎng)絡，形成了所謂的“Aldol-switch”硫酯酶樣 (Thioesterase-like)氫鍵網(wǎng)絡，從而使STS的環(huán)化機制與CHS不同，所以Thr132殘基在STS和CHS不同的環(huán)化機制中起著至關重要的作用[49]。

隨后Austin等將MsCHS中與歐洲赤松STS構象不同的4個區(qū)域內(nèi)共18個位點突變?yōu)镾TS中對應的氨基酸而構建18×CHS突變體，結果發(fā)現(xiàn)該突變體能夠合成白藜蘆醇，在功能上與STS類似 (表1)。對18×CHS突變體Apo和白藜蘆醇復合物晶體結構的解析發(fā)現(xiàn)，突變區(qū)域顯示STS-like的構象變化，證實了硫酯酶樣構象變化是導致STS Aldol型環(huán)化反應的原因。進一步在18×CHS突變體的基礎上 (保留18×CHS中已經(jīng)引入的STS-like構象變化的突變)，再引入擾亂其硫酯酶樣氫鍵網(wǎng)絡的點突變而構建多個18×(+1)CHS突變體 (T132A、S131A、E192Q)，結果發(fā)現(xiàn)這些突變體中白藜蘆醇的合成量減少而查爾酮的合成量增加，再次確認了STS活性腔Cys164附近由Ser338-H2O-Thr132-Glu192形成的氫鍵網(wǎng)絡對其特異的Aldol型環(huán)化反應具有至關重要的作用[49]。

基于對葡萄Vitis viniferaSTS同源建模的結果，Bhan等預測，葡萄STS T197G突變體中底物結合口袋及環(huán)化口袋的體積將增大。體外酶促反應結果顯示，當以4-香豆酰CoA和丙二酰CoA為底物時，STS T197G突變體產(chǎn)生了一種新的由香豆酰衍生的五酮產(chǎn)物Resorcylic acid(表1)。進一步研究表明，T197G替代使得突變體中底物結合及環(huán)化口袋的整體體積由 1029.2 ?3增大至1134.3 ?3，從而使突變體較野生型能夠多接受1個乙酰基而形成五酮中間體，后者再經(jīng)過C2?C7 Aldol型縮合形成五酮產(chǎn)物Resorcylic acid[50]。該研究表明，通過對STS-like酶的理性改造，可以通過C2?C7 Aldol型縮合而產(chǎn)生自然界不存在的新化合物。

3.7 苯亞甲基丙酮合酶

2001年，Abe等在掌葉大黃R.palmatum中首次克隆到苯亞甲基丙酮合酶 (Bezalacetone synthase,BAS)基因[18]。RpBAS與CHS的不同之處在于它僅催化起始底物4-香豆酰CoA與1分子丙二酰CoA通過一步脫羧縮合形成二酮產(chǎn)物——苯亞甲基丙酮。序列比對結果表明，在其他植物和細菌的Ⅲ型PKSs家族成員中均高度保守的Phe215殘基在RpBAS中被Leu替代。CHS中疏水性的Phe215位于活性腔的入口處，推測該位點控制著聚酮鏈延伸反應的次數(shù)[37,51]。

2003年，Abe等將RpBAS的214IL突變?yōu)镸sCHS對應的氨基酸殘基，結果發(fā)現(xiàn)突變后的RpBAS I214L/L215F在pH 6.5時表現(xiàn)出CHS酶活性，該結果證實了214IL殘基確實與RpBAS二酮產(chǎn)物苯亞甲基丙酮的形成有關，RpBAS中活性位點Phe215的缺失導致聚酮鏈的延伸在二酮中間體階段即被打斷 (表1)[52]。隨后，他們又將黃芩Scutellaria baicalensisCHS的214LF突變?yōu)镮L，結果黃芩CHS L214I/F215L突變體的CHS活性明顯下降，三酮化合物BNY成為主要產(chǎn)物，但無論是野生型還是突變體中均未檢測到二酮化合物苯亞甲基丙酮。進一步對黃芩CHS F215殘基進行的一系列突變 (F215W、F215Y、F215S、F215A、F215H和F215C)研究結果顯示，所有突變后的酶蛋白體外酶促反應產(chǎn)物中均未檢測到BA。該結果暗示，RpBAS可能在進化上晚于CHS，前者由后者進化而來。RpBAS蛋白215位置上的Leu對于該酶的BAS活性是必需的，對應于CHS同一位置上的Phe的缺失導致RpBAS中聚酮鏈的延伸在二酮中間體階段即被打斷[52]。該研究也是通過修飾活性位點周圍的單個氨基酸殘基而改變Ⅲ型PKSs功能多樣性的有趣實例。

2007年，Abe等對RpBAS C197T、C197G、G256L、S338V定點突變的研究結果表明，這4個突變體的產(chǎn)物模式均未改變，只是S338V突變導致酶活性較野生型增加2倍，而G256L突變則使酶活性下降2倍，但C197T和C197G這2個突變體的功能幾乎與野生型相同，該結果排除了Cys197可能作為RpBAS第2個活性位點的推測[40]。

2010年，Morita等報道了野生型RpBAS和合成查爾酮的RpBAS I207L/L208F(RpBAS氨基酸編號)突變體1.8 ?的晶體結構[41]。RpBAS與MsCHS活性位點的結構對比顯示，RpBAS中Leu208殘基的主鏈構象與MsCHS相似，但其側鏈伸入RpBAS活性腔內(nèi)，所以導致其活性腔體積縮小。另外，RpBAS中緊鄰活性位點Cys的Ser331(對應MsCHS的Ser338)對于催化活性的調(diào)控至關重要，如前文所述，RpBAS S338V突變使其苯亞甲基丙酮合成活性增加2倍，也佐證了該位點對于二酮化合物的形成具有重要作用[40]。晶體結構解析顯示，RpBAS中Ser331的羥基旋轉了近120°，堵塞了MsCHS中香豆酰結合口袋的入口[7]。上述RpBAS晶體結構中Leu208和Ser331構象改變的結果導致MsCHS中的香豆酰結合口袋在RpBAS活性腔中消失，使其活性腔體積 (350 ?3)縮小到僅為MsCHS(750 ?3)的一半，活性腔體積的縮小導致RpBAS中聚酮鏈的延伸在二酮中間體階段即被打斷，從而合成二酮化合物。RpBAS I207L/L208F突變體晶體結構的解析顯示，突變體中第208位氨基酸殘基的替換為野生型中原本埋藏的香豆酰結合口袋打開了一個入口，使得聚酮鏈延伸反應次數(shù)增加到3次，因而突變體恢復了查爾酮形成活性[41]。

RpBAS晶體結構解析還顯示，MsCHS中保守的 Thr132(對應 MsCHS氨基酸編號)在RpBAS中被Leu所替換，從而導致RpBAS活性腔體積縮小，使RpBAS只能形成二酮產(chǎn)物而不能形成四酮產(chǎn)物[41]。2010年，Shimokawa等對Thr132進行了一系列的定點突變研究 (L132G，L132A，L132S，L132C，L132T，L132F，L132Y，L132W，L132P)，結果顯示，L132T突變恢復了RpBAS的查爾酮合酶活性，而L132A、L132S、L132C突變則增加產(chǎn)物的鏈長而形成CTAL(表1)，同源建模揭示可能是由于這些突變恢復了RpBAS活性腔的香豆酰結合口袋[53]。

3.8 二苯甲酮合酶

金絲桃Hypericumandrosaemum的二苯甲酮合酶BPS催化起始底物苯甲酰CoA與3分子丙二酰CoA通過脫羧縮合形成2,4,6-三羥基二苯甲酮 (2,4,6-trihydroxybenzophenone)，該酶還可以利用3-羥基苯甲酰-CoA(3-hydroxybenzoyl-CoA)和N-甲基鄰氨基苯甲酰-CoA為起始底物，活性分別是苯甲酰CoA為起始底物時的18.8%和10.9%，但不能利用肉桂酰CoA為起始底物。但該植物的CHS則可以利用肉桂酰CoA為起始底物 (活性為香豆酰CoA為起始底物時的87.5%)，同時還可以利用苯甲酰CoA和3-羥基苯甲酰-CoA為起始底物。氨基酸序列比對顯示，位于CHS活性腔的Gly256、Leu263、Phe265和 Ser338在BPS中分別被Ala260、Met267、Tyr269和Gly342所替代(BPS氨基酸編號)。定點突變結果表明，BPS突變體或者與野生型功能類似 (如G342S，A260G/M267L/Y269F)，或者喪失二苯甲酮和查爾酮形成活性 (如A260G，A260G/G342S，M267L/Y269F/G342S，A260G/M267L/Y269L/G342S)；而 CHS L263M/F265Y/S338G突變體卻轉變?yōu)?個對苯甲酰CoA較香豆酰CoA具有更高活性的酶，即突變后的CHS在功能上已轉變?yōu)?個BPS(表1)[19]。該研究結果也表明，BPS可以由CHS通過少數(shù)幾個氨基酸的替換進化而來，而反過來即由BPS轉變成CHS則很難，這與蕓香ACS可以通過3個氨基酸的突變 (S132T/A133S/V265F)轉變成CHS而CHS則很難轉變?yōu)锳CS的報道相一致[35]。

2009年，Klundt等對金絲桃BPS活性口袋內(nèi)的T135(對應MsCHS中T132)突變?yōu)長eu后發(fā)現(xiàn)，原本催化苯甲酰CoA與3分子丙二酰CoA聚合形成二苯甲酮的BPS在功能上轉變?yōu)?個苯基吡喃酮合酶 (Phenylpyrone synthase,PPS)。該位點的突變改變了野生型BPS的底物與產(chǎn)物特異性，突變后的BPS催化苯甲酰CoA與2分子丙二酰CoA合成6-苯基-4-羥基-吡喃酮 (6-phenyl-4-hydroxy-pyrone)，而且與野生型不同的是，突變后的BPS不再接受3-羥基苯甲酰-CoA為其底物 (表1)。同源建模后發(fā)現(xiàn)，金絲桃BPS T135L突變體中Leu的側鏈可能伸進延伸口袋內(nèi)阻斷了聚酮鏈的延伸路徑；同時，T135L替換可能在突變體中打開了一個新的口袋 (該口袋入口在野生型中被堵塞)，通過Leu側鏈與生長中的聚酮鏈苯基之間的互作，活性口袋中的三酮中間體被重新定向進入突變體中新形成的口袋中。同源建模顯示新口袋的體積為168 ?3，足以容納1個苯基(144 ?3)，但是卻不能容納生長中的聚酮鏈再添加第3個乙?；?，最終三酮中間體經(jīng)過雜環(huán)內(nèi)酯化形成苯基吡喃酮 (Phenylpyrone)[54]。同源建模的結果合理解釋了T135L突變體底物與產(chǎn)物特異性顯著改變的機理，該研究也充分證明，單一活性位點氨基酸殘基的改變完全可以徹底改變一種Ⅲ型PKS原有的活性而產(chǎn)生另一種全新的酶。

3.9 喹諾酮合酶

木橘Aegle marmelos的喹諾酮合酶QNS催化喹諾酮類生物堿的合成。2013年，Resmi等鑒定了木橘的QNS并進行了定點突變研究。木橘Q(mào)NS具有廣泛的底物特異性，可以接受多種芳香類及脂肪類CoA作為起始底物，在以N-methylanthraniloyl-CoA為主要底物時，QNS在體外酶促反應中可以形成喹諾酮和吖啶酮，可能是1個雙功能酶?；谕葱缘慕Y構建模發(fā)現(xiàn)，Ser132和Ala133是位于QNS活性口袋的2個關鍵氨基酸殘基 (MsCHS中對應Thr132和Ser133)，為了研究其功能，通過定點突變構建了QNS S132T/A133S雙突變體和QNS S132T/A133S/V265F三突變體。同源建模顯示，這2個突變體的活性腔體積較野生型明顯縮小，喪失了結合較大起始底物的機會。隨后的體外酶促反應證實QNS S132T/A133S雙突變體能夠以香豆酰CoA為起始底物催化3分子乙酰CoA縮合形成柚皮素查爾酮，即QNS在功能上已完全轉變?yōu)?個CHS，而QNS S132T/A133S/V265F三突變體以香豆酰CoA為起始底物時未能檢測到產(chǎn)物(表1)。同時，這2個突變體以N-methylanthraniloyl-CoA為底物時未形成產(chǎn)物，也進一步驗證了同源建模的結果[30]。該研究也與蕓香ACS可以通過3個氨基酸的突變 (S132T/A133S/V265F)轉變成CHS的結果一致[35]。該研究也表明，木橘Q(mào)NS蛋白可能是由CHS超家族中一個進化上相關的成員僅僅通過2個氨基酸殘基的替換進化而來，同時該研究也是通過基因操作產(chǎn)生新型生物堿骨架的成功范例。

3.10 烷基乙酮CoA合酶和烷基喹諾酮合酶

最近，Matsui等從藥用植物吳茱萸Evodia rutaecarpa中鑒定了2個新的植物Ⅲ型聚酮合酶ADS和AQS，并對其功能進行了研究[32]。體外功能分析表明，ADS和AQS能夠協(xié)同催化N-methylanthraniloyl-CoA和丙二酰CoA縮合形成生物堿類物質(zhì)2-烷基喹諾酮 (2-alkylquinolone，2AQ)。其中ADS能夠高效催化癸?；鵆oA(Decanoyl-CoA)與1分子丙二酰CoA脫羧縮合形成癸酰基乙酮CoA(Decanoyldiketide-CoA)，而AQS則特異性催化ADS的羥化產(chǎn)物Decanoyldiketide acid與N-methylanthraniloyl-CoA脫羧縮合形成2AQ骨架。隨后作者分別解析了ADS與CoA-SH復合物1.80 ?和AQS 2.20 ?的晶體結構，并構建了一系列的ADS和AQS Y215V突變體。ADS系列突變體 (W332Q、W332I、W332V、W332A、W332G以及C191G、C191A)的體外功能檢測并結合晶體結構解析結果表明，Trp332和Cys191對于ADS產(chǎn)物的形成具有至關重要的作用，這兩個位點決定了該酶蛋白活性腔的結構，從而調(diào)控其底物和產(chǎn)物的特異性。而對AQS Y215V突變體的體外功能檢測并結合晶體結構解析結果顯示，AQS的Tyr215殘基主要通過控制該酶蛋白的CoA結合通道的構象而調(diào)控其底物和產(chǎn)物的特異性[32]。

4 總結與展望

不同類型的Ⅲ型PKSs晶體結構解析以及基于定點突變的結構與功能分析表明，活性位點周圍的單個或是少數(shù)氨基酸殘基的性質(zhì)可以決定活性口袋空間的大小和催化反應的特異性。同時，不同種類的植物Ⅲ型PKSs催化口袋的體積和活性位點氨基酸殘基的性質(zhì)可以直接影響PKSs底物的特異性和產(chǎn)物類型，從而產(chǎn)生了不同的催化反應和結構迥異的聚酮化合物分子。

近年來，越來越多的具有不同功能的植物Ⅲ型PKSs基因被克隆和鑒定功能，極大地拓寬了人們對Ⅲ型PKSs催化反應類型的認識。當不同的Ⅲ型PKSs基因被克隆以后，對各種可能影響所催化的反應 (如控制聚酮鏈長、成環(huán)機制和催化口袋大小)的氨基酸殘基進行定點突變就成為鑒定這類酶的活性殘基的首選方法。通常，突變某個Ⅲ型PKS的少數(shù)甚至是單個處于活性位點或其附近的氨基酸殘基，有可能會使酶蛋白獲得新的活性，從而催化產(chǎn)生新的聚酮化合物。通過定點突變對植物Ⅲ型PKSs進行定向改造，不僅可以研究酶蛋白的結構與功能的關系，而且可以豐富聚酮化合物的種類，為一些復雜的、具有重要藥用價值的天然或非天然聚酮化合物組合生物合成提供便利。同時，突變以后的Ⅲ型PKSs很可能可以獲得新的催化活性，這也可以為研究和闡明植物Ⅲ型PKSs超家族酶的催化機制與進化關系提供新的視野和證據(jù)。

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