許保海，崔熠，張瑤楠，3，郭永，3*，王乾興

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室，遵義 563003；2.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081，3.國家衛(wèi)生計生委男性生殖健康重點實驗室，北京 100081)

乳腺癌腫瘤干細胞是乳腺癌組織中極少數(shù)具自我更新和多向分化能力的細胞，該細胞具有化療、放療及低氧抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉(zhuǎn)移性。乳腺癌干細胞理論為根治乳腺癌開辟了新的治療途徑。傳統(tǒng)的體外研究腫瘤細胞是在二維條件下進行的，這種二維細胞培養(yǎng)方式比較方便，為大多數(shù)研究者所接受。但是傳統(tǒng)的二維平面培養(yǎng)體系采用單層細胞貼壁培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)細胞體外的增殖，細胞的基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)學(xué)都與體內(nèi)存在著差異[1]。三維培養(yǎng)與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比可以為細胞提供更類似于體內(nèi)的三維空間環(huán)境和胞外基質(zhì)環(huán)境，而且避免了體內(nèi)實驗影響因素多、周期長的問題。在本研究中，我們擬以膠原作為原料的三維支架，建立一種可以避免細胞培養(yǎng)中心因為缺乏氧氣、營養(yǎng)而凋亡的乳腺癌三維培養(yǎng)體系。在此三維體系中，通過乳腺癌腫瘤干細胞在膠原材料上的形態(tài)學(xué)特征、增殖情況，以及乳腺癌腫瘤干細胞標志CD44+/CD24-/low的表達等方面評價，為深入探討乳腺癌腫瘤干細胞的發(fā)生發(fā)展以及三維培養(yǎng)為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物的藥敏試驗平臺提供技術(shù)保障。

資料與方法

一、實驗材料

1. 細胞系：乳腺癌細胞系MCF-7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。MCF-7細胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液(GIBCO，美國)；Rat CD44 Monoclonal Antibody(IM7) APC、Mouse CD24 Monoclonal Antibody(eBioSN3(SN3 A5-2H10)) PE、Mouse IgG1 kappa Isotype Control PE、Rat IgG2b kappa Isotype Control APC(Ebioscinece，美國)；三維培養(yǎng)支架材料由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所再生醫(yī)學(xué)研究組戴建武研究員贈予。

二、實驗方法

1.實驗分組：根據(jù)不同的培養(yǎng)方法分為兩組。二維細胞培養(yǎng)組：采用傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)MCF-7細胞；三維細胞培養(yǎng)組：將MCF-7細胞接種于三維支架材料上培養(yǎng)。

2.細胞三維培養(yǎng)體系[2]：將乳腺癌細胞系MCF-7加入0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA溶液，37℃消化1 min，然后用培養(yǎng)基吹打，制備成單細胞懸液，1 000 rpm，離心5 min，棄掉上清，用培養(yǎng)基稀釋細胞到相應(yīng)濃度。將細胞懸液滴加到預(yù)先處理好的三維支架材料上，37℃培養(yǎng)1 h，然后再加入細胞培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，并將三維細胞材料轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中的小搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速控制在50～60 rpm，每天換一次培養(yǎng)基。

3.激光共聚焦顯微鏡(Confocal)觀察法：將培養(yǎng)有MCF-7細胞的三維培養(yǎng)材料取出，室溫下用PBS清洗3次，5 min/次，在避光的環(huán)境下加入200 μg/ml的熒光素雙醋酸酯(FDA)浸染1.5 min，避光用PBS清洗3次，5 min/次，放到蓋玻片上，在Confocal熒光顯微鏡(ZEISS LSM710，德國)下觀察。

4.細胞増殖實驗：將細胞進行消化、收集、重懸，使用96孔板每孔加入100 μl(含 3 000個細胞)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后每孔再加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育1 h；在450 nm波長測定各組各個復(fù)孔的吸光度(OD值)。平均值為各孔的校正吸光度值。培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

5.流式細胞術(shù)：先用胰酶消化MCF-7細胞，細胞計數(shù)后取5×106～1×107個細胞/ml，1 000 rpm，4℃離心10 min，棄上清；加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸?。? 000 rpm，4℃離心10 min，棄上清；PBS重復(fù)洗滌細胞兩次；將細胞重懸于100 μl結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)，加入5 μl Rat CD44 Monoclonal Antibody APC抗體和0.3 μl Mouse CD24 Monoclonal Antibody PE輕輕混勻，4℃ 避光孵育 40 min，每10 min混勻一次；對照組為同性對照抗體Mouse IgG1 kappa Isotype Control PE、Rat IgG2b kappa Isotype Control APC。上述細胞均用PBS洗滌2次，離心，棄上清液，用300 μl PBS重懸，再流式細胞檢測儀上檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、三維培養(yǎng)乳腺癌腫瘤干細胞形態(tài)特性

將三維培養(yǎng)的MCF-7細胞，通過膠原酶消化1.5 h后，1 000 rpm離心5 min收獲細胞，將其再次二維培養(yǎng)，觀察其在二維條件下的細胞形態(tài)特性，并與二維條件培養(yǎng)的對照細胞進行比較，結(jié)果如下：在二維條件下，MCF-7細胞平展地粘附在塑料培養(yǎng)板上，呈多邊形、鋪路石樣的上皮細胞形態(tài)(圖1A)；將細胞接種到三維支架材料上培養(yǎng)7 d后，再次將細胞二維培養(yǎng)，細胞展現(xiàn)出三角形或者長梭形，還有很多不規(guī)則形態(tài)，部分細胞還伸展出長浸潤性偽足(圖1B)。

二、激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7在三維支架材料上的生長狀態(tài)

結(jié)果顯示，MCF-7細胞(綠色熒光，F(xiàn)DA染色)均勻地生長在三維支架材料上(圖2 A、B、C)。局部放大后發(fā)現(xiàn)，MCF-7細胞生長在三維支架材料上的細胞形態(tài)不同于二維培養(yǎng)的細胞形態(tài)，清晰可見長偽足，且細胞大小不均一，細胞形態(tài)多樣(圖2D)。

A： 二維培養(yǎng)MCF-7細胞；B：三維培養(yǎng)MCF-7細胞再次二維培養(yǎng)圖1 MCF-7細胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

A：綠色熒光(×100)；B：明場；C：Merge；D：綠色熒光(×630)圖2 MCF-7細胞在三維支架材料上的生長狀態(tài)

三、三維培養(yǎng)乳腺癌腫瘤干細胞增殖特性

體內(nèi)實體腫瘤細胞具有持續(xù)增殖能力，而二維培養(yǎng)的腫瘤細胞出現(xiàn)接觸性抑制現(xiàn)象，與實體瘤細胞生命特征不相符。本實驗用CCK-8細胞增殖檢測法繪制生長曲線(圖3)。二維培養(yǎng)條件下，MCF-7細胞持續(xù)增殖到第3 天后進入平臺期，而三維培養(yǎng)后的細胞再次二維培養(yǎng)，細胞持續(xù)增殖到第4天進入平臺期，但三維培養(yǎng)后的細胞增殖速度與二維培養(yǎng)的細胞無顯著差異(P>0.05)。

四、流式細胞檢測乳腺癌干細胞相關(guān)亞群CD44+/CD24-/low的比例

分別對乳腺癌細胞系MCF-7二維培養(yǎng)及三維培養(yǎng)7 d后，通過流式細胞術(shù)檢測比較不同培養(yǎng)條件下腫瘤細胞群體中腫瘤干細胞所占比例。結(jié)果顯示，MCF-7細胞三維培養(yǎng)7 d后，CD44+/CD24-細胞所占比例增加，由38.9%增加至60.3%。結(jié)果提示，三維培養(yǎng)條件能提高乳腺癌干細胞CD44+/CD24-群體比例(圖4)。

圖3 CCK-8細胞增殖實驗

圖4 流式細胞儀檢測細胞CD44+/CD24-/low的含量

討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居全世界女性腫瘤首位，且乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢[3]。全球每年大約有20 萬患者死于乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，大約占每年新發(fā)乳腺癌患者的20%[4]。傳統(tǒng)療法如放療和化療能夠消除腫瘤腫塊，但對少數(shù)具有惡性作用的腫瘤細胞仍然不能起到完全殺死的作用，這些惡性腫瘤細胞仍然能夠存活并自我更新，進一步發(fā)展為惡性腫瘤，這一類細胞就叫做腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)，在維持腫瘤生長、血管生成及促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起決定性作用。到目前為止，已在白血病、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胃癌和肝癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞的存在[5-9]。

已有研究表明，乳腺癌中的確存在CSCs，CSCs表現(xiàn)出的自我更新、分化能力和放化療抵抗等干性特征是腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的主要因素[10-11]。2003年Al-Hajj等[12]首次在乳腺癌標本中分離出乳腺癌干細胞，發(fā)現(xiàn)幾百個Lin-CD44+CD24-/lowESA+細胞在NOD/SCID小鼠中就可以形成腫瘤。2007年，Ginestier等[13]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中高表達ALDH1的細胞也具有 CSCs特性。2011年，Golebiewska等[14]發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細胞表現(xiàn)出可以明顯增加經(jīng)過ABCG2(可導(dǎo)致藥物抵抗的主要因子)介導(dǎo)的Hoechst染色的“側(cè)群細胞”(SP)的數(shù)量。因此，利用乳腺癌干細胞的特征消除乳腺癌干細胞，為化療抵抗、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的乳腺癌病人提供一個新的治療方法[15]，就需要我們深入研究乳腺癌干細胞的自我更新和分化演變的生物學(xué)機制。

目前，傳統(tǒng)的體外研究腫瘤細胞都是在二維環(huán)境下進行的，與體內(nèi)微環(huán)境存在著差異，例如細胞增殖、細胞的基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)學(xué)等方面均存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞的三維培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，二維培養(yǎng)的細胞并不表達Claudin-7，而在三維條件下，細胞卻高表達Claudin-7和Claudin-4，這種蛋白在體內(nèi)的惡性腫瘤中是高表達的，與腫瘤細胞的遷移有直接關(guān)系。將口腔鱗癌上皮細胞接種到三維材料上培養(yǎng)一段時間，細胞不再是上皮樣形態(tài)，而是更接近成纖維樣，同體內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤分離的細胞類似[16]。因此，二維環(huán)境下培養(yǎng)的腫瘤細胞不能有效地模擬腫瘤細胞在體內(nèi)的生存狀況。另外，體內(nèi)進行的動物實驗研究周期較長，成本較高，而且由于體內(nèi)多種因素的制約及體內(nèi)和外界環(huán)境的相互影響往往使動物實驗結(jié)果變得復(fù)雜化。因此，無論是傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)還是動物學(xué)實驗，在乳腺癌干細胞研究中都具有一定的局限性。

越來越多的研究者開始將三維培養(yǎng)用于臨床前藥物體外篩選、腫瘤干細胞維持和分化、信號異常轉(zhuǎn)導(dǎo)等腫瘤基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究[17-19]。三維培養(yǎng)在少見惡性腫瘤的臨床前藥敏試驗和藥物篩選中尤為重要，可以有效避免不必要的臨床前實驗，從而減少病人資源和后續(xù)研究資金的浪費[20]。研究者們開發(fā)出了不同的三維培養(yǎng)模型來培養(yǎng)細胞，去模擬體內(nèi)組織的微環(huán)境，為研究器官的發(fā)育以及疾病的治療提供了一個新的思路[21]。如將腫瘤細胞接種到人工合成材料PLGA三維支架上，可以研究腫瘤細胞的惡性特征與環(huán)境之間的關(guān)系[22]。而用殼聚糖-藻酸鹽制作的三維支架材料，能有效地在體外模擬神經(jīng)膠質(zhì)瘤[23]。一些水凝膠例如Matrigel、藻酸鹽和透明質(zhì)酸也被用來制作三維支架材料，培養(yǎng)腫瘤細胞，研究腫瘤細胞的生命特征[24]。膠原是細胞外基質(zhì)的主要組成部分，能為細胞的粘附和遷移提供粘連位點[25]。除此之外，膠原還有著很好的生物相容性、很低的免疫源性、較好的生物降解性、一定的機械強度[26]。這些特征說明膠原是一種優(yōu)良的支架材料。傳統(tǒng)的方法是將膠原做成水凝膠的方式，培養(yǎng)腫瘤細胞，研究腫瘤細胞的生物學(xué)特性[27]。本次實驗所用原材料是膠原膜，主要成分為I型和Ⅲ型膠原，將膠原膜重新處理加工，得到膠原海綿支架[2]。它是一種多孔狀的三維支架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小為50～150 μm之間，這種多孔結(jié)構(gòu)能為細胞的粘附和增殖提供足夠的三維空間。在本研究中，在二維條件下，MCF-7細胞平展的粘附在塑料培養(yǎng)板上，呈多邊形、鋪路石樣的上皮細胞形態(tài)，這種情況下細胞是單層生長，細胞和細胞之間的連接很少，僅僅存在于細胞間的接觸點。將細胞接種到三維支架材料上培養(yǎng)，在三維條件下，細胞展現(xiàn)出多邊形的或者球形的形態(tài)，還有很多不規(guī)則形態(tài)，部分細胞還伸展出長浸潤性偽足。這種浸潤性偽足的出現(xiàn)，可能與細胞獲得遷移和侵襲能力相關(guān)。另外，在三維上培養(yǎng)的腫瘤細胞，細胞核出現(xiàn)了多形性，中心區(qū)少量細胞出現(xiàn)凋亡，這些現(xiàn)象同體內(nèi)實體腫瘤細胞的特性更為類似。CD44+/CD24-/low表型的細胞是乳腺癌干細胞相關(guān)亞群，也是CSCs的特征之一[28]。本實驗采用流式細胞技術(shù)對兩組的細胞分別進行了CD44+/CD24-/low表型細胞的比例的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的MCF-7細胞，其CD44+/CD24-/low細胞的比例為60.3%，而二維的僅僅為38.9%，MCF-7細胞經(jīng)三維培養(yǎng)后CD44+/CD24-/low細胞群的比例明顯增加，可初步認定以膠原為支架的三維培養(yǎng)體系能夠有效維持乳腺癌腫瘤干細胞干性。該模型可運用于探討乳腺癌腫瘤干細胞的發(fā)生發(fā)展的機制，以及三維培養(yǎng)為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物的藥敏試驗平臺。

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