曹慧，潘利，姜倩倩，鄒巖梅，束懷瑞

(1.濰坊學院 山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東 濰坊 261061；2.濰坊一中，山東 濰坊 261041；3.國家蘋果工程技術研究中心，山東 泰安 271018)

由于工業(yè)“三廢”和生活垃圾的不得當處置，污水灌溉，以及農(nóng)藥化肥的不合理使用，果園土壤已不同程度受到鎘等重金屬的污染。鎘是毒性很強的重金屬，可對果品安全生產(chǎn)及人類健康構成嚴重威脅[1]。高濃度鎘能夠誘導植物產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，對細胞膜、蛋白和核酸等生物大分子具有破壞作用，嚴重時導致細胞死亡。植物根系中的ROS主要來源于線粒體，反過來線粒體又是ROS作用的靶子，它可提高線粒體膜通透性，引起細胞色素c(Cyt c)釋放；Cyt c是線粒體呼吸鏈上傳遞電子的載體，線粒體Cyt c的流失可直接引起電子傳遞受阻或中斷，刺激線粒體膜通透性進一步開放，從而產(chǎn)生更多的ROS，繼而引發(fā)一系列下游反應，最終導致細胞受損壞死[2]。鎘脅迫使平邑甜茶根系線粒體MTP增大，膜電位(Δψm)和 Cyt c含量下降，H2O2含量升高，最終導致細胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)的發(fā)生[3]。

近幾年，越來越多的研究表明新型內(nèi)源性氣體信號分子硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S) 具有復雜的生物學活性，參與多種生理和病理過程，其在植物中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面，H2S可促進種子萌發(fā)[4]，調(diào)控保衛(wèi)細胞[5]，增強葉片光合作用[6]，延遲衰老等[7]。在植物抗逆方面，H2S可以通過減小葉片氣孔孔徑，激活抗氧化系統(tǒng)，調(diào)控離子通道活性及基因表達等參與植物對鹽堿[8]、重金屬[9]、溫度[10]等逆境脅迫的響應。并且，H2S與ROS、NO、Ca2+和植物激素等信號路徑存在相互作用，共同調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應過程[11-12]。Ca2+作為植物細胞的第二信使，胞內(nèi)Ca2+水平改變，轉(zhuǎn)導多種生理過程。Ca2+/CaM參與H2S介導的煙草懸浮細胞耐熱性的提高[13]，在谷子響應Cr6+脅迫的過程中，Ca2+調(diào)控H2S的產(chǎn)生，外源H2S促進Ca2+響應基因的表達，Ca2+作為初始信號與H2S相互作用[12]。

關于H2S對植物Cd脅迫的緩解作用已有一些報道，但多以草本植物或懸浮細胞為研究對象。果樹生長在受鎘污染的土壤中，根系首當其害，但國內(nèi)外對根系的研究遠不如對地上部的研究廣泛和深入。平邑甜茶(MalushupehensisRehd.)是優(yōu)良的蘋果砧木資源，抗性較強，在生產(chǎn)上具有重要的應用價值[14]。本試驗以平邑甜茶幼苗為材料，探究H2S能否緩解Cd脅迫對平邑甜茶幼苗根系造成的損傷，利用外源Ca2+以及Ca2+螯合劑EGTA、質(zhì)膜Ca2+通道阻斷劑La3+和鈣調(diào)素拮抗劑CPZ，研究了平邑甜茶幼苗活性氧代謝和線粒體特性的變化，以研究證明Ca2+在H2S介導重金屬脅迫信號傳導中的作用，從而為提高果樹抗逆應用研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

精選飽滿、均勻的平邑甜茶種子，用飽和漂白粉溶液消毒15 min，蒸餾水洗凈后浸泡24 h，4 ℃冰箱層積35 d，待種子露白后，播種于12 cm×18 cm營養(yǎng)缽，基質(zhì)為草炭、珍珠巖和蛭石按照3∶1∶1的比例配制。每缽播種2粒種子，待幼苗長至5～6片真葉，選取整齊一致的幼苗移入Hoagland營養(yǎng)液(pH值6.5)中進行水培，每2 d更換一次營養(yǎng)液。當幼苗生長至12～13片真葉時，用硫酸鎘(CdSO4，200 μmol/L)處理，同時在營養(yǎng)液中加入H2S供體硫氫化鈉(NaHS，購自Sigma公司)或氯化鈣(CaCl2)/鈣抑制劑處理，鈣離子專一螯合劑為EGTA，鈣離子通道阻斷劑為LaCl3或鈣調(diào)素拮抗劑為CPZ。

試驗處理為對照CK：正常營養(yǎng)液；T1：200 μmol/L Cd脅迫處理；T2：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS處理；T3：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS+10 mmol/L EGTA處理；T4：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS+50 μmol/L LaCl3處理；T5：200 μmol/L Cd+ 200 μmol/L NaHS + 50 μmol/L CPZ處理；T6：200 μmol/L CdSO4+10 mmol/L CaCl2處理。每處理3次重復，處理后第2天取根系進行活性氧代謝和線粒體特性等生理指標測定；處理后第8天取幼苗植株測定株高、莖粗和干鮮質(zhì)量等生長指標。采用軟件 SPSS和Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表繪制。

1.2 測定方法

植株生物量測定：株高(莖基部到生長點)用直尺測量；莖粗(莖基部)用游標卡尺測量；地上部和地下部鮮質(zhì)量、干質(zhì)量用稱量法和烘干法測量。

線粒體的提取和線粒體特性檢測參照蘇宏等[17]的方法。線粒體膜通透性的檢測：配制緩沖液(220 μmol/L甘露醇，70 μmol/L蔗糖，4.2 μmol/L琥珀酸鈉，pH值7.2)制備線粒體懸浮液，并用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量后調(diào)整懸浮液蛋白濃度為0.3 mg/mL，將懸浮液置于20 ℃恒溫箱中保溫2 min后，紫外分光光度計檢測540 nm處的吸光度變化。線粒體膜電位測定：配制緩沖液(250 μmol/L蔗糖，2 μmol/L Hepes，0.5 μmol/LKH2PO4，4.2 μmol/L琥珀酸鈉，pH值7.4)制備線粒體懸浮液，并調(diào)整懸浮液蛋白濃度為0.3 mg/mL。加入羅丹明123(1 mg/mL)在25 ℃恒溫箱中保溫30 min孵育后，熒光分光光度計(激發(fā)波長為505 nm，發(fā)射波長為534 nm)上檢測熒光強度，每個樣品測定3次，每次間隔5 min，樣品熒光強度取3次的平均值。線粒體細胞色素c/a測定：用牛血清白蛋白(0.2 %)制備線粒體懸浮液，調(diào)整懸浮液蛋白含量為0.5 mg/mL。紫外分光光度計檢測550 nm和630 nm處的吸收值，2種波長的吸收值之比即為Cyt c/a。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響

如表1所示Cd脅迫導致平邑甜茶幼苗的株高、莖粗、地上部干、鮮質(zhì)量，地下部干、鮮質(zhì)量顯著下降，明顯抑制幼苗生長。Cd脅迫下分別添加外源H2S供體NaHS和CaCl2均緩解了Cd對幼苗生長的抑制，株高、莖粗和植株干鮮質(zhì)量均顯著增加，二者緩解水平相當；Cd脅迫下添加NaHS的同時添加鈣離子專一螯合劑EGTA，鈣離子通道阻斷劑LaCl3或鈣調(diào)素拮抗劑CPZ抑制了外源H2S對平邑甜茶幼苗生長的緩解作用，株高、莖粗、地上部干質(zhì)量和地下部干、鮮質(zhì)量都比Cd脅迫下僅添加NaHS的顯著下降(表1)。

表1 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響Tab.1 Effects of Ca2+ and H2S on growth of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

注：同列數(shù)值后不同字母表示差異性達5%顯著水平。圖1-4同。

Note：Different letters within the same column indicate significant difference at 5% level. The same as Fig.1-4.

2.2 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系細胞死亡的影響

伊文思藍(Evans blue)是可透過受損的細胞膜將細胞染成藍色的非侵透性染料，被細胞截留的伊文思藍量可用來反映細胞的受損程度，染色越深根系活力越低，死亡細胞數(shù)量越多[3]。如圖1所示，200 μmol/L CdSO4處理平邑甜茶根系48 h，可導致根系細胞截留伊文思藍量顯著增加，說明大量根系細胞死亡。Cd脅迫下添加NaHS，在外源H2S的作用下，根系細胞死亡數(shù)量比單獨Cd處理降低了40.4%。Cd脅迫下添加外源Ca2+也降低了根系細胞死亡數(shù)量，與Cd+NaHS處理的水平相當，而比單獨Cd處理的降低了39.3%，差異顯著。而Cd脅迫下添加NaHS的同時添加EGTA、LaCl3或CPZ的處理根系細胞死亡數(shù)量又高于Cd+NaHS的處理。

圖1 Ca2+和H2S對 Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系細胞死亡數(shù)量的影響Fig.1 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the cell death quantity in roots of Malus hupehensisRehd. seedlings under Cd stress

2.3 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的影響

由圖2-B可知，相同處理下，平邑甜茶根系H2O2含量(以鮮質(zhì)量計)變化與超氧陰離子產(chǎn)生速率的變化基本一致：Cd脅迫下，根系活性氧爆發(fā)，H2O2含量保持在較高水平；Cd+NaHS和Cd+CaCl2處理的H2O2含量分別比單獨Cd處理的顯著降低了30.7%和29.6%，二者水平相當；Cd+ NaHS+EGTA、 Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的H2O2含量比Cd+NaHS處理的又分別提高了30.3%,24.0%和30.0%，差異顯著。

Cd脅迫下，蘋果幼苗根系內(nèi)MDA含量(以鮮質(zhì)量計)顯著提高，比對照增加了45.0%；添加外源H2S顯著緩解了Cd脅迫下MDA在根系中的積累，MDA含量比單獨Cd脅迫處理降低了25.9%；Cd+ NaHS +EGTA、 Cd+ NaHS +LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理抑制了單獨H2S的作用，與單獨Cd脅迫處理水平相當。Cd脅迫下添加外源Ca2+也抑制了MDA產(chǎn)生，MDA含量比單獨Cd脅迫處理降低了16.8%(圖2-C)。

圖2 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的影響Fig.2 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the production rate， H2O2 content and MDA content in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.4 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的影響

Cd脅迫條件下，平邑甜茶幼苗根系SOD活性(以鮮質(zhì)量計)明顯升高，比對照高74.7%。Cd脅迫下添加NaHS或CaCl2處理的均進一步提高了根系SOD活性，分別比Cd單獨處理的增加了31.8%和41.5%。Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的抑制了H2S的作用，SOD活性較Cd+NaHS處理的顯著下降，與單獨Cd脅迫處理水平相當(圖3-A)。

由圖3-B、C可知，POD和CAT活性(以鮮質(zhì)量計)的變化趨勢與SOD相似，即Cd脅迫下顯著高于對照，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2處理的進一步提高，Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的顯著抑制了H2S的作用，與單獨Cd脅迫處理水平相當。

圖3 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the antioxidant enzymes activities in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.5 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系線粒體特性的影響

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變通道(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放程度決定膜通透性(MPT)的轉(zhuǎn)變，MPTP的過度開放使MPT不斷增大，線粒體膜蛋白在540 nm處的吸光度減小。如圖4-A，在單獨Cd處理下根系線粒體膜蛋白吸光度顯著低于對照。Cd脅迫下NaHS或CaCl2處理穩(wěn)定了Cd脅迫下根系線粒體膜的通透性，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2處理下MPTP開放程度分別比Cd處理降低了21.0%，18.8%。Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的不同程度上抑制了H2S的作用，其中Ca2+專一螯合劑EGTA，Ca2+通道阻斷劑LaCl3的抑制效果顯著，MPTP開放程度比Cd+NaHS處理的又分別提高了9.72%和9.14%。鈣調(diào)素拮抗劑CPZ抑制效果稍差，MPTP開放程度比Cd+NaHS處理的提高了8.02%。

線粒體膜電位(Δψm)是評價線粒體功能的特征指標，MPTP的過度開放會導致Δψm不可逆地改變。Cd處理的根系線粒體Δψ與對照相比顯著降低。Cd脅迫下添加NaHS提高了線粒體Δψ，與單獨Cd處理差異顯著；Cd脅迫下添加NaHS的同時添加Ca2+專一螯合劑EGTA，Ca2+通道阻斷劑LaCl3和鈣調(diào)素拮抗劑CPZ抑制了H2S的作用，根系線粒體Δψ與Cd+NaHS處理的均差異顯著。Cd脅迫下添加外源Ca2+處理的根系線粒體Δψ與Cd+NaHS處理的水平相當(圖4-B)。

與對照相比，在Cd處理下，隨著MPTP 開放程度的增大，Δψm的降低，Cyt c/a 也顯著降低。與單獨Cd脅迫相比，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2處理顯著提高了根系線粒體Cyt c/a。而Cd脅迫下添加NaHS的同時，添加鈣離子相關抑制劑均顯著抑制了H2S的緩解作用，其中Cd+ NaHS +CPZ處理的抑制效果最明顯，Cyt c/a比Cd+NaHS處理降低了29.9%(圖4-C)。

圖4 Ca2+和H2S誘導Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系線粒體膜透性、膜電位和細胞色素c/a的影響Fig.4 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the membrane absorbance， Δψ，Cyt c/a of mitochondrial in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，在較嚴重的脅迫條件下，線粒體是響應逆境信號的初始位點，通過啟動一系列代謝過程來增強植物的環(huán)境適應[17]。鎘脅迫下連接線粒體內(nèi)外膜的MPTP過度開放，使線粒體膜MPT不斷增大，導致呼吸鏈解偶聯(lián)，Δψm下降甚至消失，松散得結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上的Cyt c穿過線粒體膜進入細胞質(zhì)。Cyt c是線粒體電子傳遞的組成成分，它的脫落破壞線粒體抗氧化防御體系，導致ROS和MDA等物質(zhì)的大量產(chǎn)生，誘導細胞死亡，使細胞正常生理代謝受阻，幼苗生長受到明顯抑制[3]。

近年來越來越多的證據(jù)表明，H2S可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和非酶類物質(zhì)含量，清除細胞內(nèi)過量的ROS，緩解逆境對細胞的氧化損傷[6-7，11]。但H2S對植物遭遇鎘脅迫后的線粒體功能是否具有調(diào)節(jié)作用未見報道。本試驗中在鎘脅迫下添加NaHS處理可顯著減少平邑甜茶幼苗根系細胞的死亡數(shù)量，減輕Cd對幼苗生長的抑制。這可能是由于外源H2S可有效提高線粒體的完整性，抑制線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生；同時H2S激活了抗氧化酶系統(tǒng)，SOD、CAT、POD活性增強，使產(chǎn)生的ROS能很快被還原，減輕Cd脅迫引起的膜脂過氧化對線粒體膜的傷害和對電子傳遞鏈的阻抑，保護了線粒體功能，緩解傷害。

植物在受到非正常刺激時，可以通過細胞質(zhì)膜上Ca2+通道的開放或細胞內(nèi)鈣庫的Ca2+釋放提高細胞質(zhì)基質(zhì)中的Ca2+水平，從而形成Ca2+信號，引發(fā)系列生理生化代謝[18-19]。已有研究表明，一定濃度的外源Ca2+處理可以有效提高大蒜對鎘脅迫的抗性及葡萄對光氧化脅迫的適應[20-21]。本研究中，Cd脅迫下添加外源Ca2+處理減小了根系MPTP 的開放程度，顯著提高了根系線粒體的Δψm和抗氧化酶活性，使ROS的水平顯著低于單獨Cd處理，膜脂過氧化保持在較低的水平，最終緩解了Cd脅迫對幼苗生長的抑制。但添加NaHS的同時添加鈣離子專一螯合劑EGTA，鈣離子通道阻斷劑LaCl3或鈣調(diào)素拮抗劑CPZ后，外源H2S的作用被解除。這是因為逆境下胞外Ca2+通過Ca2+通道的激活進入胞內(nèi)，引起胞質(zhì)Ca2+濃度瞬間增加，Ca信號與其靶蛋白CaM結(jié)合成Ca2+-CaM啟動復雜的信號轉(zhuǎn)導體系，導致植物做出相應的應答反應[22]。本試驗中，當Ca2+被EGTA螯合、Ca2+通道被LaCl3抑制及Ca2+-CaM的生成被CPZ抑制時，Ca2+的信號傳導被阻斷，使Ca2+對植物體的生理功能被解除。這表明，Ca2+在H2S誘導的保護酶活性增強，線粒體功能穩(wěn)定，活性氧清除能力提高，膜脂過氧化降低，從而緩解鎘脅迫傷害的過程中起重要作用，而H2S的作用可能依賴于Ca2+。植物響應逆境的信號傳導是復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，可能存在多種交叉對話，在某個地方匯集啟動Ca2+依賴或非依賴性的信號傳導途徑，因此，明確H2S和Ca2+的作用需要進一步的試驗支持。

參考文獻：

[1] Azevedo R A，Gratao P L，Monteiro C C，et al. What is new in the research on cadmium-induced stress in plants?[J]. Food and Energy Security，2012，1(2)：133-140.

[2] Bartoli C G，Gomez F，Martinez D E，et al. Mitochondria are the main target for oxidative damage in leaves of wheat (TriticumaestivumL.)[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55(43)：1663-1669.

[3] 姜倩倩. 鎘脅迫下平邑甜茶根系細胞死亡及其中介因素研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2011.

[4] Li Z G，Gong M，Liu P. Hydrogen sulfide is a mediator in H2O2-induced seed germination inJatrophaCurcas[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2012，34(6)：2207-2213.

[5] Garc′a-Mata C，Lamattina L.Hydrogen sulphide，a novel gasotransmitter involved in guard cell signaling[J]. The New Phytol，2010，188(4)：977-984.

[6] 周超凡，吳幗秀，李 婷，等. 外源 H2S 對低溫下日光溫室黃瓜光合作用及抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 園藝學報，2016，43(3)：462-472.

[7] Zhang H，Hu S L，Zhang Z J，et al. Hydrogen sulfide acts as a regulator of flower senescence in plants[J]. Postharvest Biology and Technology，2011，60(3)：251-257.

[8] Christou A，Manganaris G A，Papadopoulos I，et al. Hydrogen sulfide induces systemic tolerance to salinity and non-ionic osmotic stress in strawberry plants through modification of reactive species biosynthesis and transcriptional regulation of multiple defence pathways[J]. Journal of Experimental Botany，2013，64(7)：1953-1966.

[9] Chen J，Wang W H，Wu F H，et al. Hydrogen sulfide alleviates aluminum toxicity in barley seedlings[J]. Plant and Soil，2013，362(1/2)：301-318.

[10] Li Z G，Ding X J，Du P F. Hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfide-improved heat tolerance in maize and involvement of proline[J]. Journal of Plant Physiology，2013，170(8)：741-747.

[11] Cui W T，Chen H P，Zhu K K，et al. Cadmium-induced hydrogen sulfide synthesis is involved in cadmium tolerance inMedicagosativaby reestablishment of reduced (homo) glutathione and reactive oxygen species homeostases[J]. PLoS One，2014，9(10)：e109669.

[12] Fang H H，Jing T，Liu Z Q，et al. Hydrogen sulfide interacts with calcium signaling to enhance the chromium tolerance inSetariaitalica[J]. Cell Calcium，2014，56(6)：472-481.

[13] Li Z G，Gong M，Xie H，et al. Hydrogen sulfide donor Sodium hydrosulfide-induced heat tolerance in tobacco (NicotianatabacumL.) suspension cultured cells and involvement of Ca2+and calmodulin[J]. Plant Science，2012，185(9)：185-189.

[14] 魏國芹，曹 輝，孫玉剛，等. 硫化氫對淹水平邑甜茶根系形態(tài)構型，葉片活性氧和光合特性的影響[J]. 應用生態(tài)學報，2017，28(10)：3267-3273.

[15] Steffens B，Sauter M. Epidermal cell death in rice is regulated by ethylene，gibberellin，and abscisic acid[J]. Plant Physiology，2005，139(2)：713-721.

[16] 趙世杰，史國安，董新純. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1998.

[17] 蘇 宏，李麗杰，馬懷宇，等. 變溫條件下鈣對山定子根系線粒體功能的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2014，47(19)：3866-3873.

[18] 張 召，梁元存，王 利，等. 鈣對酸化處理平邑甜茶根系抗氧化酶活性及線粒體功能的影響[J]. 林業(yè)科學，2012，48(8)：87-93.

[19] 應葉青，杜 旭，華姜琴，等. 干旱脅迫下毛竹根尖Ca2+分布及外源Ca2+作用機制[J]. 林業(yè)科學，2013，49(4)：141-146.

[20] 李 賀，連海峰，劉世琦，等. 鎘脅迫對大蒜苗生理特性的影響及施鈣的緩解效應[J]. 應用生態(tài)學報，2015，26(4)：1193-1198.

[21] 王曉芳，相 昆，孫 巖，等. 葉面肥對“巨峰”葡萄光氧化脅迫的緩解效應[J]. 果樹學報，2017，34(3)：312-320.

[22] Yang T B，Poovaiah B W. Calcium/calmodulin-mediated signal network in plants[J]. Trends in Plant Science，2003，8(10)：505-512.