張子義，趙 陽，梁紅勝，樊明壽

(1.內蒙古農業(yè)大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業(yè)大學 農學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科多年生的草本植物，它的塊莖可供食用，是僅次于小麥、水稻和玉米的第四大重要糧食作物。內蒙古是我國馬鈴薯的主產區(qū)之一，馬鈴薯產業(yè)已經成為內蒙古地區(qū)農業(yè)經濟發(fā)展的主導產業(yè)。馬鈴薯是喜鉀作物，它對鉀素的吸收量大于氮和磷，且鉀素直接影響馬鈴薯的產量和質量[1-3]。K+是植物體內最為豐富的無機一價陽離子，可以參與植物的多種生理生化過程[4]。鉀轉運蛋白主要包括 KUP/HAK/KT 家族、HKT/Trk家族、CHX 家族和 KEA 家族。而其中的 KUP/HAK/KT家族是在生物界內最早被發(fā)現的，它不僅數目最多而且功能最豐富，它的主要作用是介導植物中鉀離子等元素的吸收轉運和根部生長素的運輸[5-7]。目前，已在擬南芥、水稻、大麥、桃樹中分別預測得到13，27，5，17個 KUP/HAK/KT鉀轉運體[8-11]。

研究不同鉀素濃度下馬鈴薯鉀轉運體KUP6和KUP7基因表達量的不同，并分析它們之間的關系，以及不同鉀濃度對馬鈴薯幼苗鉀素含量的影響，從而探索馬鈴薯生長的適宜鉀濃度，對提高馬鈴薯產量和提高鉀素的利用效率具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗材料為脫毒馬鈴薯費烏瑞它組培苗，由內蒙古正豐馬鈴薯種業(yè)股份有限公司提供。試劑為柱式植物總RNA抽提純化試劑盒，購自上海生工生物有限公司，反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自寶生物工程有限公司。水培試劑購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設計

馬鈴薯組培苗置于 20 ℃，18 h 光照(光照強度9 000 lx)/6 h 黑暗條件下培養(yǎng)。水培營養(yǎng)液參照Hongland營養(yǎng)液，其中，4個鉀素濃度(K2SO4)處理見表1，隨機排列，4次重復。

表1 不同濃度的鉀處理Tab.1 Treatment with different concentrations of potassium

1.3 總RNA提取及cDNA反轉錄

在培養(yǎng)組培苗30 d時，隨機選取不同處理的馬鈴薯幼苗，剪取葉片之前將剪刀浸入液氮處理，剪取的葉片放入事先做好標記的塑料袋中并放入液氮中保存。將取好的葉片放入研缽中進行充分研磨，使葉片磨成粉末，整個研磨過程中要及時加入液氮，防止葉片融化。采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取馬鈴薯葉片總RNA。用超微量紫外可見分光光度計Q500對RNA進行濃度測定，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質量。選用TaKaRa公司生產的反轉錄試劑盒合成cDNA的第一鏈。

1.4 基因表達分析

使用SYBR Green I 熒光染料法，在LightCycler480( Roche Diagnostics) 實時熒光定量PCR儀上對馬鈴薯幼苗轉錄表達水平進行分析。根據 SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書配制反應體系，每個反應3次重復。反應體系中含有 10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，引物各1 μL(5 μmol/L)，稀釋的 cDNA 模板5 μL，滅菌水3 μL，總體系 20 μL。反應程序為 95 ℃ 預變性30 s；95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個循環(huán)。反應結束后做溶解曲線分析，用2-ΔΔCt法分析數據。

1.5 測定項目及方法

分別在馬鈴薯幼苗種植后的10，20，30 d進行取樣，選取具有代表性的3株，運用鉬銻抗比色法[12]測定馬鈴薯幼苗根、莖、葉中鉀的含量。

1.6 數據分析

采用SPSS軟件進行相關統計分析。

2 結果與分析

2.1 RNA的提取

用試劑盒成功提取RNA后，由于實時熒光定量PCR需要高品質的RNA，所以需要對提取物先進行分析。由圖1可知，較亮的帶為28S RNA，下面較暗的帶是18S RNA，28S帶的亮度大概是18S帶的2倍，而5S RNA帶則不明顯。所以，RNA未降解，可以用作后續(xù)試驗。

圖1 馬鈴薯RNA 電泳結果Fig.1 The result of agar gel electrophoresis of potato

2.2 實時熒光定量PCR結果分析

首先查詢擬南芥中KUP6和KUP7基因表達的蛋白的一級結構，再從馬鈴薯中查找到與其一級結構最相似的蛋白，然后查看其基因序列，最后利用Premier 5.0 軟件設計最適引物。熒光定量 PCR 所用引物見表2。

表2 引物序列 Tab. 2 Primer sequence

通過實時熒光定量PCR檢測了KUP6和KUP7基因表達水平，結果見圖2,與鉀離子濃度0.01 mmol/L相比，當鉀離子濃度為0.10 mmol/L其基因表達量增加不明顯；當鉀離子濃度為1.00 mmol/L時，KUP6和KUP7基因表達量最高，且與其他處理之間都具有顯著差異，分別為LA處理的2.82，2.28倍；而鉀離子濃度為10.00 mmol/L時，與處理LA 和L 具有顯著差異，KUP6和KUP7基因表達量分別為LA的1.68，1.86倍，說明過高或較低的鉀離子濃度都不利于KUP6和KUP7基因的表達。

a、b、c.表示在0.05水平上顯著。圖3-5同。a,b,c.Correlation is significant at the 0.05 level.The same as Fig.3-5.

2.3 鉀素在根、莖、葉中的含量

從圖3可以看出，在各個階段H和M處理之間根系的鉀素含量變化為30.2～32.5 g/kg，且在不同階段兩處理之間均無顯著差異，說明M處理根系中鉀素已經達到了飽和。在水培后20 d內，培養(yǎng)液鉀素含量在0.01～1.00 mmol/L時，隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增加，根系鉀素含量增加。在水培第10天，LA、L和M處理根系鉀素濃度分別為1.5，24.9，32.5 g/kg；在水培第20天，LA、L和M處理根系鉀素濃度分別為2.0，9.6，31.0 g/kg，且處理LA、L和M之間均具有顯著差異。在水培30 d時，M處理和H處理與LA和L處理有顯著差異，但L和LA處理之間沒有顯著變化。L處理鉀素含量隨著培養(yǎng)天數的增加呈下降的趨勢。

圖3 不同處理下根系鉀素的含量Fig.3 The potassium content in potato roots

馬鈴薯莖中鉀素含量隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增加而增加(圖4)，在水培后第20天內，處理H和M之間沒有差異，但其與LA和L之間有顯著差異，且L與LA之間也有顯著差異。在水培第10天，LA、L和M處理中莖鉀素濃度分別為2.0 ，26.3，37.1 g/kg；在水培第20天，LA、L和M處理中莖鉀素濃度分別為13.2 ，24.0，58.3 g/kg；在水培第30天時，處理LA和L與M和H之間有顯著差異，但在數值上差距倍數縮小，說明處理LA和L 在生長過程中累積了鉀素，并維持了一定的鉀素濃度；H處理的鉀素含量達65.1 g/kg，與其他處理之間均具有顯著差異，且隨著培養(yǎng)天數的增加LA和H處理鉀素莖內含量呈上升趨勢。

圖4 不同濃度處理下莖中鉀素的含量Fig.4 The potassium content in potato stems

馬鈴薯葉中鉀素含量也隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增加而增加(圖5)，在試驗第10天，4個處理之間均具有顯著差異，LA、L、M和H處理的鉀素濃度分別為4.2，18.6，26.2，32.4 g/kg，說明水培10 d所測試的葉片鉀素濃度與水培的鉀素濃度呈一定的正相關性。在水培試驗20 d時，L處理與LA處理之間無顯著差異，H處理與M處理也沒有顯著差異，但M和H處理與LA和L之間具有顯著差異。水培試驗第30天，H處理鉀素濃度達到46.0 g/kg，與其他處理之間有顯著差異；M處理鉀素濃度為32.9 g/kg，與LA和L均具有顯著差異，LA和L之間無顯著差異。

圖5 不同濃度處理下葉中鉀素的含量Fig.5 The potassium content in potato leaves

3 結論與討論

植物細胞有2種機制來介導鉀離子的跨膜吸收，它們分別是鉀離子通道蛋白介導的低親和性鉀吸收系統和鉀轉運體介導的高親和性鉀吸收系統。當細胞外鉀離子濃度高時，低親和性鉀轉運系統發(fā)揮作用，這種吸收主要是由離子通道蛋白調節(jié)的被動運輸的過程；當細胞外的鉀離子濃度低時，高親和性鉀轉運系統起主要作用。雖然對于多數植物來說，它們吸收鉀離子主要依賴于低親和性的鉀轉運系統，但是高親和性鉀轉運系統也在植物生長發(fā)育中發(fā)揮了不可替代的作用，尤其是在外界存在低鉀脅迫時，它能夠讓植物更好地生存。而且鉀離子通道蛋白和鉀轉運體并不是只能在一種機制中起作用，鉀離子通道蛋白可以在高親和性鉀吸收系統中起作用，鉀轉運體也可以在低親和性鉀吸收系統中起作用[13-15]。

已有的研究結果表明，KUP/HAK/KT家族是植物中一類非常重要的鉀離子轉運體蛋白，它們在鉀離子高親和性吸收系統中起作用，也就是在外界鉀離子濃度過低時介導植物鉀離子的吸收。而植物中的鉀離子通道蛋白和鉀轉運體往往是通過轉錄水平的變化或翻譯后蛋白的修飾來參與植物對低鉀脅迫的響應[16-18]。

本試驗利用實時熒光定量PCR法檢測了不同鉀素濃度下KUP6和KUP7轉錄水平基因表達量的變化，結果顯示，低鉀處理后KUP6和KUP7的表達水平都沒有發(fā)生很顯著的變化；在鉀素濃度為1.00 mmol/L時，KUP6和KUP7的表達水平都上升明顯；高鉀處理后KUP6和KUP7的表達水平都上升但其上升的幅度減小了。而葉片中的鉀素含量隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增大呈遞增的趨勢。以上試驗結果說明，鉀轉運體KUP6和KUP7不僅是通過轉錄水平的調控來參與馬鈴薯對鉀素的響應，很可能是由翻譯后蛋白的修飾來響應鉀素脅迫的，由于目前人們對于此類鉀轉運體蛋白生理功能的研究還非常有限[19-20]，所以，還有很大的研究空間，希望本研究對馬鈴薯生長發(fā)育中合理分配鉀素資源以及對鉀轉運體KUP6和KUP7的分子機制的后續(xù)研究有所幫助。

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