姜 童，王 輝，陳 寧，付 翔，楊延杰，林 多

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

簇生椒(Capsicumanmuumvar .fasciculatum)為茄科辣椒屬辣椒的變種，因椒果均較小，又稱為小辣椒，是一種世界性蔬菜或調(diào)味品[1]。簇生椒在中國(guó)的種植面積逐漸擴(kuò)大，在辣椒產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位。目前，山東魯西南地區(qū)簇生朝天椒栽培面積日益擴(kuò)大，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占有重要地位，辣椒栽培品種混亂、定名混亂、雜交種同物異名、異物同名現(xiàn)象也逐漸顯現(xiàn)，嚴(yán)重干擾了辣椒種業(yè)的健康發(fā)展。加強(qiáng)種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)及保護(hù)新育品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)是改良和推廣辣椒品種的關(guān)鍵，羅本釩[2]利用分子標(biāo)記法與農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)法進(jìn)行了小白菜遺傳多樣性分析及優(yōu)良性狀鑒定；秦倩等[3]利用SSR標(biāo)記進(jìn)行了油橄欖品種表型和品種多樣性的聚類分析；朱姝等[4]進(jìn)行8個(gè)水稻抗條紋葉枯病分子標(biāo)記有效性的驗(yàn)證及評(píng)價(jià)。插入/缺失多態(tài)性(Insertion/deletion，InDel)標(biāo)記是由于同一位點(diǎn)處的DNA序列在不同個(gè)體間發(fā)生了核苷酸片段的插入/缺失，根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性即是InDel標(biāo)記[5]，具有帶型簡(jiǎn)單、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、檢測(cè)容易等特點(diǎn)。目前，InDel標(biāo)記技術(shù)在番茄、水稻、玉米等作物的種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系方面的研究領(lǐng)域已有報(bào)道[6-8]，但對(duì)于利用InDel標(biāo)記進(jìn)行辣椒品種相似度評(píng)價(jià)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用InDel分子標(biāo)記對(duì)供試的8份商品名不同的簇生朝天椒進(jìn)行農(nóng)藝性狀構(gòu)建指紋圖譜來(lái)評(píng)價(jià)魯西南地區(qū)簇生朝天椒的品種相似度，對(duì)一些地方特有辣椒品種的保護(hù)及種子市場(chǎng)的規(guī)范具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自濟(jì)寧地區(qū)商品名不同的簇生朝天椒品種，共計(jì)8份，于2016年6月分別到各鄉(xiāng)鎮(zhèn)進(jìn)行采樣編號(hào)(表1)，樣品-80 ℃保存，用于基因組DNA的提取。

表1 試驗(yàn)材料Tab.1 Experimental materials

1.2 農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)方法

2016年6月和9月，采用常規(guī)方法對(duì)魯西南地區(qū)8個(gè)商品名不同的簇生朝天椒品種進(jìn)行株高、果實(shí)個(gè)數(shù)、分枝數(shù)、單株簇?cái)?shù)、平均每簇果數(shù)、葉色、鮮單果重等農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行調(diào)查；10月中旬烘干測(cè)定樣品干質(zhì)量，并計(jì)算干鮮比，果實(shí)色價(jià)采用GB10783方法測(cè)定。

1.3 InDel分子標(biāo)記評(píng)價(jià)方法

1.3.1 InDel引物篩選 辣椒基因組DNA提取、質(zhì)量檢測(cè)、InDel-PCR擴(kuò)增程序及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)等參照姜童等[9]的方法進(jìn)行。供試材料為8個(gè)植物學(xué)性狀差異較大的干制辣椒品種(表2)。引物參照Li等[10]開(kāi)發(fā)的辣椒InDel引物，從12條染色體上共251對(duì)InDel引物中篩選出60對(duì)InDel引物(圖1)，引物由上海Sangon公司合成。

表2 用于InDel引物篩選的供試材料Tab.2 The tested materials for the screening of InDel primers

圖1 60對(duì)引物在辣椒染色體物理圖譜上的位置Fig.1 Location of 60 pairs primers on the physical map in pepper chromosome

1.3.2 指紋圖譜構(gòu)建 選用篩選的25對(duì)InDel引物對(duì)8個(gè)不同商品名的辣椒品種進(jìn)行擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶數(shù)進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

InDel標(biāo)記的數(shù)據(jù)記錄用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。根據(jù)電泳結(jié)果，擴(kuò)增材料在同一引物中，位點(diǎn)較高的記1，位點(diǎn)較低重復(fù)出現(xiàn)的記0，條帶缺失記-。用SPSS 14.0軟件完成試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)和UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 簇生朝天椒農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

簇生朝天椒植株農(nóng)藝性狀比較結(jié)果顯示(表3)，8個(gè)品種株高均在79.1～96.4 cm，抗倒伏性較好；分枝數(shù)集中在4～5簇；單株簇?cái)?shù)最多的品種為SYJ-5，株型緊湊，單株簇?cái)?shù)較少的品種為SYJ-6。從平均每簇果數(shù)調(diào)查來(lái)看，8個(gè)品種的平均單簇果個(gè)數(shù)為5個(gè)左右；葉色較突出的品種為SYJ-2、SYJ-3、SYJ-6、SYJ-8，表現(xiàn)為深綠色，其他品種均為正常綠色。

簇生朝天椒品種果實(shí)性狀比較結(jié)果顯示(表4)，8個(gè)品種果長(zhǎng)為5.75～6.12 cm，SYJ-2和SYJ-5的果長(zhǎng)存在顯著差異，各品種辣椒果寬為1.36～1.43 cm，8個(gè)品種的果寬差異不顯著。SYJ-2、SYJ-6的折合干椒產(chǎn)量分別為5 248.50，5 165.10 kg/hm2，且均顯著高于其他品種(4 412.85～5 038.20 kg/hm2)。

表3 八個(gè)朝天椒品種植株農(nóng)藝性狀比較Tab.3 The comparison of agronomic traits among eight clustered pepper varieties

表4 八個(gè)朝天椒品種果實(shí)性狀比較Tab.4 The comparison of fruit traits among eight clustered pepper varieties

2.2 InDel分子標(biāo)記評(píng)價(jià)

2.2.1 InDel 引物篩選 試驗(yàn)中通過(guò)60對(duì)InDel引物在生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的8份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，其中25 對(duì)引物具有多態(tài)性(表5)，部分引物的篩選結(jié)果如圖2所示，引物CIDH908、CIDH426有多態(tài)性擴(kuò)增，所有材料均能擴(kuò)增出清晰的條帶且多態(tài)性好，穩(wěn)定性高；本試驗(yàn)所用引物為以上步驟篩選出的25對(duì)具有多態(tài)性的InDel引物生物學(xué)性狀差異較小、遺傳背景較窄的8個(gè)不同商品名的簇生朝天椒進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建。

2.2.2 指紋圖譜構(gòu)建 本試驗(yàn)用25對(duì)具有多態(tài)性的引物在8個(gè)不同商品名的簇生朝天椒材料檢測(cè)的部分引物擴(kuò)增圖譜如圖3，4所示。這25 對(duì)InDel引物在8份簇生辣椒材料中共擴(kuò)增出 160個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小在 130～350 bp。只有引物CIDH267在本研究中8份簇生辣椒材料產(chǎn)生不同的位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小在180～200 bp(圖3)，其中，24對(duì)InDel引物擴(kuò)增檢測(cè)中無(wú)位點(diǎn)差異，部分引物擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖4。采用25對(duì)InDel引物對(duì)8個(gè)辣椒品種構(gòu)建指紋圖譜(表6)，通過(guò)指紋圖譜看出，只有SYJ-2和SYJ-6在引物CIDH267中與其他6個(gè)辣椒品種存在1個(gè)位點(diǎn)差異。參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-玉米、水稻品種鑒定-DNA指紋方法判定標(biāo)準(zhǔn)(NY/T1433-2007)，結(jié)果表明，這8個(gè)不同商品名的簇生朝天椒為疑似同種。

表5 InDel標(biāo)記信息Tab.5 The information of InDel marker primers

1～8.生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的8份材料。1-8.The variety of biological properties of the larger differences and distant relationship between the eight materials.

M.Marker；1～8依次是朝天椒品種SYJ-1～SYJ-8。圖4同。M.Marker；1-8 is the variety of the clustered pepperSYJ-1-SYJ-8. The same as Fig.4.

Ⅰ.CIDH28；Ⅱ.CIDH776；Ⅲ.CIDH602；Ⅳ.CIDH360。

2.2.3 八個(gè)簇生朝天椒品種相似度評(píng)價(jià) 選取株高、分枝數(shù)、單株簇?cái)?shù)、平均每簇果數(shù)、果長(zhǎng)、果肩徑、單鮮果重、單干果重、色價(jià)等級(jí)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)做數(shù)據(jù)均一化處理，利用SPSS 14.0軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行表型性狀UPGMA聚類分析(圖5)，在遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí)聚為一個(gè)大類，包含8個(gè)品種；當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.58時(shí)聚為3類，第一類包含4個(gè)品種(SYJ-1、 SYJ-3 、SYJ-4、 SYJ-7 )，第二類包含3個(gè)品種(SYJ-2、SYJ-6、SYJ-8)，第三類只有品種SYJ-5；當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.4時(shí)聚為5類，第一類包含3個(gè)品種(SYJ-1、 SYJ-3 、SYJ-4)，第二類為品種SYJ-7，第三類為品種SYJ-2和SYJ-6，第四類為品種SYJ-8，第五類只有品種SYJ-5；當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.17時(shí)聚為6類，第一類為品種SYJ-1，第二類包含品種SYJ-3和SYJ-4，第三類為品種SYJ-7，第四類包含品種SYJ-2和SYJ-6，第五類為品種SYJ-8，第六類只有品種SYJ-5。表明該8個(gè)不同商品名辣椒品種形態(tài)相似程度大，親緣關(guān)系相對(duì)較近，品種相似度較高。

表6 簇生朝天椒品種InDel指紋圖譜Tab.6 The digital fingerprints of InDel markers on clustered pepper

圖5 簇生朝天椒農(nóng)藝性狀UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA method cluster analysis for eight clustered pepper varieties based on agronomic traits

3 討論與結(jié)論

隨著辣椒栽培面積的不斷擴(kuò)大，品種的種類也不斷更新，遺傳基礎(chǔ)變得越來(lái)越狹窄，以形態(tài)形狀區(qū)分難度大，新品種的新穎性和特異性鑒定缺少憑據(jù)，種子領(lǐng)域現(xiàn)狀也存在同物異名問(wèn)題，給種子市場(chǎng)管理提出了挑戰(zhàn)。張寶璽等[11]在“十一五”期間提出，辣椒品種的同質(zhì)化嚴(yán)重，盡管培育的品種很多，而且市場(chǎng)上的辣椒品種性狀相近、同物異名的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮。目前，同質(zhì)化或相似度評(píng)價(jià)方法主要有品種特性鑒定和分子標(biāo)記鑒定，品種特性鑒定是法定的品種鑒定方法，具有準(zhǔn)確性、科學(xué)性、能更直觀地揭示品種間的來(lái)源差異等優(yōu)點(diǎn)，但也存在工作量大、成本高、時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果滯后等問(wèn)題。而DNA指紋圖譜技術(shù)則具有高效、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、能夠量化地體現(xiàn)出品種間的差異等優(yōu)點(diǎn)。因此，將這2種方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析，可以相互驗(yàn)證、相互補(bǔ)充，更能充分地揭示出地方品種(品系)的相似度及親緣關(guān)系。

利用品種特性與分子標(biāo)記進(jìn)行植物不同物種間親緣關(guān)系分析研究已被廣泛應(yīng)用。包文泉等[12]基于SSR標(biāo)記的仁用杏主栽品種鑒別和指紋圖譜構(gòu)建；王慶彪等[13]對(duì)中國(guó)50個(gè)甘藍(lán)代表品種進(jìn)行EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建；張婉等[14]對(duì)白菜品種進(jìn)行SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。通過(guò)構(gòu)建InDel 指紋圖譜從分子層面上更精確、清晰地對(duì)品種相似性進(jìn)行比較和研究。周延清等[15]對(duì)河南栽培大豆的RAPD品種鑒定和聚類分析；宋小麗[16]進(jìn)行了親緣關(guān)系密切的12個(gè)辣椒品種的 AFLP鑒定；王明明等[17]進(jìn)行了木瓜屬品種親緣關(guān)系的SRAP分析。隨著近年來(lái)測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，分子標(biāo)記InDel技術(shù)自產(chǎn)生以來(lái)，因有帶型簡(jiǎn)單、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn)在植物指紋構(gòu)建及種質(zhì)資源遺傳多樣性的鑒定和分類研究得到廣泛的應(yīng)用。Wang等[18]基于InDel和SSR序列遺傳連鎖圖譜進(jìn)行蕪菁擬染色體匯編；梁爽[19]利用InDel和SSR整合大白菜分子遺傳圖譜；胡俏強(qiáng)等[20]進(jìn)行了糯玉米雜交種純度InDel分子標(biāo)記鑒定與田間鑒定的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，InDel標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果呈極顯著正相關(guān)，可用于糯玉米雜交種純度鑒定。而分子標(biāo)記InDel在辣椒親緣關(guān)系分析和品種相似度分析方面用的不是很廣泛，利用品種特性與構(gòu)建InDel指紋圖譜結(jié)合對(duì)品種相似性進(jìn)行比較和研究未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。

本研究對(duì)8個(gè)不同商品名的簇生朝天椒品種進(jìn)行基本農(nóng)藝性狀調(diào)查，基于表型數(shù)據(jù)(簇生朝天椒農(nóng)藝現(xiàn)狀UPGMA聚類分析) 與InDel分子標(biāo)記(簇生朝天椒進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建)相結(jié)合進(jìn)行了生物學(xué)性狀差異較小、遺傳背景較窄的不同商品名的8個(gè)簇生朝天椒的親緣關(guān)系及品種相似度分析，表明該8個(gè)不同商品名辣椒品種相似程度較大，同質(zhì)化嚴(yán)重且存在同物異名現(xiàn)象。本研究結(jié)合 InDel分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜數(shù)據(jù)與農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)矩陣存在極顯著正相關(guān)，這與Lefebvre等[21]結(jié)果相似。由此認(rèn)為，本研究擴(kuò)增的InDel DNA片段散布于整個(gè)辣椒基因組中，并與本試驗(yàn)的表型性狀QTR有很高的關(guān)聯(lián)性。因此，結(jié)合簇生朝天椒農(nóng)藝性狀與綜合利用InDel分子標(biāo)記分析，能更準(zhǔn)確鑒定、評(píng)價(jià)魯西南地區(qū)簇生朝天椒品種的相似度，對(duì)地方辣椒品種的品質(zhì)及品種保護(hù)具有一定的利用價(jià)值，有效地緩解了辣椒栽培品種混亂、定名混亂、種子同質(zhì)化的現(xiàn)象，有利于種子市場(chǎng)的規(guī)范和種業(yè)的健康發(fā)展。

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