籍貴蘇，呂 芃 ，杜瑞恒 ，劉國慶 ，侯升林 ，馬 雪 ，李素英 ，王金萍，趙秀萍

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，河北省雜糧研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家甜高粱改良分中心，河北 石家莊 050035；2.邯鄲市永年區(qū)農(nóng)牧業(yè)局，河北 邯鄲 057050)

高粱抗旱耐瘠、耐鹽堿，是當(dāng)今世界尤為重要的能源作物和糧食作物。甜高粱生物產(chǎn)量高，其植體和莖稈豐富的糖汁均是生物乙醇生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原料[1]。粒用高粱在我國歷史上曾經(jīng)是一個非常重要的濟(jì)貧作物，而在缺水少雨的非洲，其仍然是人類食物的保障[2]。最近的研究證明，食用高粱對現(xiàn)代人類的健康，如減少炎癥、肥胖、糖尿病以及高血脂等疾病上有重要作用[3]。

高粱基因組較小(750 Mb)，被認(rèn)為是二倍體模式化作物，同時也是能源植物如多倍體甘蔗和高生物量植物芒草類的參考植物[4-5]。高粱多態(tài)性標(biāo)記的開發(fā)是圖譜建立、數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀研究的基礎(chǔ)，也是分子輔助育種和基因克隆的關(guān)鍵。高粱單核苷酸多肽性遍布于高粱的整個基因組，分布廣、數(shù)量多，對其進(jìn)行開發(fā)有助于擴(kuò)大高粱的標(biāo)記數(shù)量，為高密度圖譜的建立、基因定位及基因開發(fā)意義重大。

最初高粱分子標(biāo)記是用玉米和水稻等的探針或基因片段開發(fā)出來的，Hulbert等[6]經(jīng)過對谷子、約翰遜草、甘蔗和珍珠粟等探針的比較，證明玉米探針最適合高粱PCR擴(kuò)增。Berhan等[7]利用玉米的基因片段開發(fā)了96個標(biāo)記，并用此構(gòu)建了較早的高粱遺傳圖譜。隨后較多的RFLP、AFLP等標(biāo)記開發(fā)出來，對高粱多態(tài)性鑒定、圖譜構(gòu)建、性狀鑒別等起到了重要的作用。

Peng等[8]用323個RFLP標(biāo)記對高粱的一個重組自交系(RIL)群體137個個體進(jìn)行分析，構(gòu)建了10個連鎖群，連鎖群上的標(biāo)記數(shù)為13～61個，長度為55～205 cM，總長度為1 347 cM，并把高粱與玉米的圖譜的同源性作了詳細(xì)的比較。Boivin等[9]整合了AFLP和RFLP構(gòu)建的遺傳圖譜，形成了由443個位點(diǎn)總長1 899 cM的遺傳圖譜。

SSR具有穩(wěn)定性和重復(fù)性好、分布廣和費(fèi)用低等特點(diǎn)，深受遺傳學(xué)家的歡迎，尤其在遺傳圖譜的制作及連鎖群的確認(rèn)上有很大的優(yōu)勢。1997年Taramino等[10]開發(fā)了13個SSR標(biāo)記，用其檢測高粱的多態(tài)性及對高粱進(jìn)行分析，把其中7個SSR標(biāo)記標(biāo)定在現(xiàn)有的高粱RFLP 圖上。Kong等[11]通過高粱核基因文庫合成了38個SSR引物，并用其對18個高粱品種和一個近等基因雜交群體進(jìn)行擴(kuò)增，把其中的31個SSR標(biāo)記定位在高粱的連鎖群上。2013年Kong等[5]又用203個SSR標(biāo)記對由高粱與高粱近緣種(Sorhumbicolor×Sorghumpropinquum)雜交的F2和RIL群體進(jìn)行分析和圖譜構(gòu)建，比較了141個等位基因位點(diǎn)在F2與RIL群體的10 條連鎖群上的變化，提出RIL群體作圖比F2群體更有優(yōu)勢。Wu等[12]用新開發(fā)的38個SSR標(biāo)記連同以往的300多個標(biāo)記對一個F2群體進(jìn)行分析，構(gòu)建了16個連鎖群，分布在10個染色體上，證實(shí)了這些標(biāo)記與原公布的染色體的位置有驚人的相似。另外，SSR標(biāo)記在數(shù)量性狀的標(biāo)定上也顯現(xiàn)出了它的優(yōu)勢，Guan等[13]利用118個SSR標(biāo)記對粒用高粱石紅137×甜高粱L-甜雜交的F2和F2：3的186個單株群體進(jìn)行分析，構(gòu)建了連鎖群，對高粱含糖量、莖稈鮮質(zhì)量及莖稈糖含量進(jìn)行了QTL定位分析。Han等[14]對SSR標(biāo)記把高粱干濕莖稈基因標(biāo)定在第6染色體上。Wang等[15]通過多環(huán)境的SSR標(biāo)記分析，認(rèn)為染色體上與生物產(chǎn)量相關(guān)的主要QTL與多個性狀相關(guān)，并存在著上位性效應(yīng)。

多種標(biāo)記的綜合利用，無疑對挖掘高粱遺傳信息，建立圖譜具有深遠(yuǎn)的意義。Tao等[16]用8個SSR和155個RFLP標(biāo)記對120 個 F5RIL群體進(jìn)行分析，構(gòu)建了一個長度為1 400 cM 的高粱圖譜，分為21個連鎖群，定位了3個性狀。Menz等[4]對BTx623× IS3620C的 RIL群體用2 926個標(biāo)記構(gòu)建了長度為1 713 cM的10條連鎖群。Ramu 等[17]開發(fā)了基于基因組序列的物理圖譜，包含7 013個SSR標(biāo)記，125個保守內(nèi)含子掃描引物標(biāo)記和100個已知基因位置。Haussmann等[18]為了將這些標(biāo)記統(tǒng)一起來，用AFLP、SSR、RFLP 和 RAPD 標(biāo)記對2個RIL群體進(jìn)行了圖譜構(gòu)建，并將2個圖譜合并成一套圖譜，合并后的圖譜包含了339個標(biāo)記，11個連鎖群，總長度1 424 cM。

分子標(biāo)記在高粱的數(shù)量性狀定位和分子標(biāo)記輔助育種上取得了一定的進(jìn)展。Agrama等[19]對抗蚜蟲基因進(jìn)行了定位，Murray等[20-21]對高粱含糖量進(jìn)行了定位。Amelework等[22]用SSR標(biāo)記對高粱品種的配合力和雜種優(yōu)勢進(jìn)行研究，李浩杰等[23]利用分子標(biāo)記輔助育種對高粱籽粒的淀粉含量進(jìn)行了遺傳改良。

2009年P(guān)aterson等[24]完成了高粱的測序，為高粱的基因組分析、遺傳研究及基因的發(fā)掘利用等奠定了基礎(chǔ)。隨后，基于基因序列的研究，Bouchet等[25]用SNP標(biāo)記對高粱的抽穗期和株高進(jìn)行了標(biāo)定。以往的標(biāo)記盡管在高粱研究上起到了巨大的貢獻(xiàn)，但只是限于有限的標(biāo)記和特定的位點(diǎn)，基因遍布于整個基因組的各個部位，突變也千變?nèi)f化，并且在標(biāo)記不到的區(qū)間就很難找到潛在的基因，有限的標(biāo)記難以滿足分子遺傳研究和標(biāo)記輔助育種的需求。高通量測序由于可直接讀取DNA序列變異，準(zhǔn)確性高，同時還可機(jī)械化操作等迅速得到應(yīng)用，用于基因組研究的SLAF(Specific lengh amplified fragments)標(biāo)記，具有標(biāo)記數(shù)量眾多、均勻分布及避開重復(fù)序列等特點(diǎn)[26]。截至目前，其在芝麻、谷子、大豆等作物上得到廣泛利用[27-29]，尤其在作物高密度遺傳圖譜構(gòu)建及功能基因驗(yàn)證上應(yīng)用較多，而在高粱上的應(yīng)用報道較少。用這種全基因組全方位掃描來篩選性狀相關(guān)的基因標(biāo)記方法，開發(fā)高密度遺傳標(biāo)記對優(yōu)異基因的發(fā)掘及在高粱育種上的應(yīng)用意義重大。

本研究對甜高粱與粒用高粱雜交的親本及F2遺傳群體進(jìn)行基因組酶切，然后用高通量測序?qū)ζ淙蚪M進(jìn)行分析，開發(fā)SLAF標(biāo)簽并編碼親本及F2群體的基因型獲得有效的SNP標(biāo)記，旨在為遺傳圖譜構(gòu)建、有益基因發(fā)掘、基因克隆和功能基因研究奠定基礎(chǔ)，為分子標(biāo)記輔助篩選和優(yōu)異基因的利用提供材料和依據(jù)，提高我國高粱的研究水平，促進(jìn)我國高粱和生物質(zhì)能的發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 研究材料

供試材料為甜高粱品種科特爾與粒用高粱J204雜交的F2群體。 J204 為來自美國的一個材料(由J14859變異單株選育而來)。2012年將該群體的父母本各10株和136個單株個體點(diǎn)播種植，生育期間按正常的田間管理進(jìn)行，成熟時進(jìn)行單株考種和數(shù)據(jù)采集。

1.2 DNA提取及處理

1.2.1 試驗(yàn)方法 CTAB方法提取DNA：生長期間對每株的最上一片葉片取樣，-80 ℃保存待DNA提取，研磨樣品中加入850 μL的CTAB，65 ℃水浴40 min后加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，振蕩并離心，取上清加入0.6～0.7倍體積的異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)，沉淀，再離心，沉淀用75%的乙醇清洗2次，晾干，然后溶于100 μL TE中。

1.2.2 對DNA進(jìn)行酶切 根據(jù)參考序列的 GC 含量、重復(fù)序列情況和基因特點(diǎn)等信息，選用MseⅠ的酶切組合，插入片段為 380～410 bp，對各樣品DNA進(jìn)行酶切。酶切過程用基因組 DNA 500 ng，加入NEB(New England Biolabs，NEB) 緩沖液 41 μL，補(bǔ)水至 50 μL，然后在37 ℃水浴中處理 15 h。反應(yīng)結(jié)束后，用QIAGEN 膠提取盒純化，50 μL EB回溶。

1.2.3 樣品測序前的處理 酶切產(chǎn)物進(jìn)行5′末端修復(fù)、3′末端加 A，連接測序接頭，橋式擴(kuò)增便于將連接產(chǎn)物錨定在Flowcell上，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，通過PCR擴(kuò)增切膠產(chǎn)物，增大文庫量，建好的文庫用 Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序[29]。

1.3 信息分析

1.3.1 SLAF標(biāo)記開發(fā) 對各個樣品同一位點(diǎn)處的 DNA片段序列，經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增、測序，得到多個相同或相似的序列，使用 Blast 比對軟件(http：//www.blast.net/)，通過序列之間存在的SNP 或 Indel來確定多態(tài)性，通過序列相似性將同一位點(diǎn)的片段序列進(jìn)行聚類，每一個位點(diǎn)確定為一個群，群中高深度片段即為潛在基因型，采用關(guān)鍵參數(shù)為：tileSize=10 ，連續(xù)比對堿基數(shù)，最短比對單位長度stepSize=6 ，最短比對單位間的間距minScore=45 。聚類后，數(shù)據(jù)再進(jìn)行測序錯誤的糾正，以每一個群中準(zhǔn)確的高深度(≥50)序列作為參考，將低深度序列比對到參考序列上，對錯配的堿基(錯配數(shù)<5)進(jìn)行糾正。消除錯誤SNP[29]。

1.3.2 編碼基因型 糾錯后獲得具有 1個或多個(二倍體中，小于或等于 4個)等位基因的群，定義為SNP標(biāo)記，只有1個等位基因的標(biāo)記為非多態(tài)性標(biāo)記，有2～4個等位基因的標(biāo)記為多態(tài)性標(biāo)記。利用8種分離模式(ab × cd、ef× eg、hk ×hk、lm × ll、nn × np、aa × bb、ab × cc和cc × ab) 對多態(tài)性標(biāo)記編碼基因型[29]。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

株高：從地上部植株基部到穗頂?shù)拈L度。莖節(jié)數(shù)：除穗莖節(jié)外，地上部可見莖節(jié)的個數(shù)。莖粗：用卡尺測量的莖稈從下數(shù)第三節(jié)莖稈的粗度。穗莖長：從最上一節(jié)結(jié)到穗柄的長度。百粒質(zhì)量：去凈谷殼和柄的百粒飽滿籽粒稱重。粒色：籽粒表皮顏色。抽穗期：本試驗(yàn)的抽穗期記載是從播種到穗抽出包葉的持續(xù)天數(shù)單株掛牌，為計算方便，本研究統(tǒng)一減去43 d得到的數(shù)值。穗長：從穗柄到穗頂?shù)拈L度。穗鮮質(zhì)量：從穗柄切下的鮮穗稱重。莖鮮質(zhì)量：去除穗和葉片后的植株稱重。莖汁量：用榨汁機(jī)將莖稈扎壓3次后，稱取莖汁液的質(zhì)量。莖糖量：取莖稈汁液一滴置入手持測糖儀 PAL-1 (日本 ATAGO Co.公司生產(chǎn))上，記載讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記開發(fā)群體的親本表型性狀的差異分析

較大的親本差異有助于發(fā)掘更多的多態(tài)性，在調(diào)查的12個性狀中，除了莖粗、穗長和抽穗期3個性狀外，其他性狀在父母本之間均達(dá)到顯著差異(t檢測)(表1)。

表1列出了作圖群體親本和F2的平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤?？梢?，作圖群體的親本遺傳差異明顯，除莖粗(P=0.77)、穗長(P=0.71)和抽穗期(P=1.00)外，調(diào)查的其他9個性狀均有顯著差異(P≤0.05)。從F2的標(biāo)準(zhǔn)誤和平均值可見，群體有較大的分離，變異范圍較大，其中株高274.92 cm、莖節(jié)數(shù)12.52個、穗長22.20 cm、莖鮮質(zhì)量307.49 g，均超過其高值親本科特爾，而F2的莖粗1.90 cm、穗質(zhì)量53.30 g，則超過親本J204。 這些性狀屬超高親遺傳。穗莖長、莖汁量、糖錘度和百粒質(zhì)量則屬偏高親遺傳，抽穗期F2均值為11.28 d，低于其雙親，說明F2的分離單株平均抽穗比親本早3 d，屬超親遺傳。另外，籽粒顏色在雙親之間顏色的分離也較大，出現(xiàn)了黃和灰色的非親本色遺傳分離。所以，作為多態(tài)性標(biāo)記的開發(fā)群體，該試驗(yàn)群體完全符合試驗(yàn)需求。

表1 親本和F2群體12個性狀的差異比較及檢測Tab.1 Significance analysis and test for 12 traits in the parents and F2 population

注：PH. 株高；SN. 莖節(jié)數(shù)；SD. 莖粗；TNL. 穗莖長；SL. 穗長；FWS. 莖鮮質(zhì)量；JWS. 莖汁量；Brix.糖錘度；FWS.穗質(zhì)量；HGW. 百粒質(zhì)量；HD.抽穗期；CC. 種皮顏色。F2種皮顏色分離：白/23，褐/68，紅/22，黃/1，灰/3，紫/5 。

Note：PH. Plant hight；SN.Stem nods No.；SD.Stem diameter；TNL.Top nod length；SL.Spike length；FWS.Fresh weight of stem；JWS.Juice weight of stem；FWS.Fresh weight of spike；HGW.100-grain weight；HD.Heading date；CC.Coat color. The coat color distribution in the F2population is white/ 23，dark red/68，red/22，yellow/1，grey/3，purple/5.

2.2 測序結(jié)果統(tǒng)計

2.2.1 標(biāo)記篩選基本情況 本次酶切片段長度為1～3 247 bp，總計302.6萬個，多數(shù)片段分布在500 bp之內(nèi)，占總片段的89.26%(圖1)。

圖1 酶切片段長度統(tǒng)計Fig.1 The frequency of reads lengths

本次測序采用雙端測序，測序reads長度80 bp，各樣品使用的reads 兩端各40 bp長度進(jìn)行統(tǒng)計(表2)。

由表2 可知，本次共開發(fā)的reads 數(shù)為43 528 021個，母本為2 598 472個，父本為3 134 524個，子代的reads數(shù)為205 083～454 258個，平均為290 732.5，GC平均含量為44.9%。

對上述測序reads進(jìn)行原始數(shù)據(jù)評估、聚類和糾錯等，開發(fā)到的親本及各樣品的SLAF標(biāo)記數(shù)量以及測序深度如圖2， 3所示。

表2 親本和F2測序的reads 數(shù)和平均GC含量Tab.2 Reads numbers and GC contents from the parents and F2 individuals

圖中M和P為母本和父本，其他編號為130個F2個體。圖3同。M and P refer to maternal and paternal parents and others refer to the F2 individuals.The same as Fig.3.

圖3 親本和F2個體的測序深度Fig.3 The sequencing depth in the parents and F2 individuals

可見，父母本的SLAFs 標(biāo)簽數(shù)分別44 895和42 100，測序深度在父本中為19.78 ，母本中為16.22。F2群體每個個體的 SLAF 標(biāo)簽為26 737～39 291，平均為 33 445.06，測序深度為2.24～3.72，平均為2.79。

通過對高深度片段的潛在基因型分析，共選定了 52 928 個較適宜的SLAF 標(biāo)簽，這些標(biāo)簽的測序總深度達(dá)到13 756 880。其中，多態(tài)性標(biāo)簽為 6 353 個(SNP 標(biāo)記)，占12.02%，測序深度累計為1 785 955，非多態(tài)性標(biāo)簽占46 575個，占88%，測序深度累計為11 970 925。

2.2.2 標(biāo)記分型基本情況 根據(jù)F2群體基因型編碼規(guī)則對 6 353 個多態(tài)性 SNP標(biāo)記編碼了基因型，其中，5 829 個標(biāo)記成功分型，占多態(tài)性 SNP 標(biāo)記的91.75%，不能成功分型的標(biāo)記524個，占8.25%。成功分型的標(biāo)記中，多數(shù)被編碼的基因型為aa×bb，占87.37%，其次為lm×ll和nn×np，均為241個，hk×hk(143個)，其他類型個數(shù)均很少，最低的是ab×cd，僅有2個(圖4、表3)。

圖4 成功分型標(biāo)記各類型的頻數(shù)Fig.4 The frequency of each genotype

表3列出了編碼基因型的基本情況，524個不能分型的標(biāo)記中包含了父母本缺失和重復(fù)序列等標(biāo)記，占到99%。成功編碼SNP標(biāo)記中，父母本測序深度小于10 的標(biāo)記占比最高，占45.7%(合計2 662個)，其次非aa×bb類型的標(biāo)記和SNP數(shù)多于3個的標(biāo)記，分別占9.00%和4.90%。另外，還有可能為測序錯誤的標(biāo)記和hk×hk標(biāo)記中雜合度低于0.55的標(biāo)記合計109個，剩余為有效的 SNP 標(biāo)記2 246個。這2 246 個精選標(biāo)記平均測序深度達(dá)到3.25，占有效標(biāo)記百分比為100%，其F2個體的各樣品完整度為85.99%～98.84%，平均為94.99%，可應(yīng)用于進(jìn)一步的圖譜構(gòu)建。

表3 多態(tài)性標(biāo)記分型及去留基本情況一覽表Tab.3 The genotyping information and marker selection of polymorphic markers

3 討論與結(jié)論

本次研究利用了父母本在多性狀上有較大差異的組合進(jìn)行SLAF標(biāo)簽的開發(fā)，檢測了株高、莖稈鮮質(zhì)量、莖汁液鮮質(zhì)量、含糖量等12個性狀，其中，有9個性狀在父母本之間差異顯著。父母本差異越大，獲得的多態(tài)性標(biāo)記就越多，因此，本試驗(yàn)設(shè)計為更有效地發(fā)掘多態(tài)性標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。高通量測序方法的應(yīng)用，檢測了覆蓋全基因組的堿基差異和變化，從而加大了標(biāo)簽開發(fā)的數(shù)量和質(zhì)量[26]，這在以往的標(biāo)記和圖譜研究中是無法達(dá)到的。該研究是從4 000多萬reads中，通過聚類和糾錯等篩選程序，獲得了52 928 個SLAF 標(biāo)簽，并在這些標(biāo)簽中得到了6 353 個多態(tài)性SNP標(biāo)記，測序深度累計為1 785 955。通過單核苷酸堿基變化獲得的分子標(biāo)記的數(shù)量之多，這在以往的研究方法和手段是難以達(dá)到的。

盡管SSR標(biāo)記克服了AFLP和RFLP標(biāo)記的隨機(jī)性和不穩(wěn)定性，但有限的數(shù)目難以滿足基因組龐大數(shù)據(jù)和豐富基因變異的需求[29]。SLAF標(biāo)簽是據(jù)基因組的特性進(jìn)行設(shè)計，更大程度地發(fā)現(xiàn)SNP、內(nèi)含子(Indelible)和外顯子(Extra)標(biāo)記，增大了標(biāo)記的數(shù)目，能更有效地標(biāo)定有益基因，為基因克隆及在遺傳育種上的應(yīng)用奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)，并可據(jù)已知的序列設(shè)計引物用于基因組比較及分子標(biāo)記輔助育種，同時作為模式作物可促進(jìn)其他作物遺傳研究的發(fā)展[5]。

該研究利用親本遺傳差異較大的材料進(jìn)行雜交，獲得性狀變異豐富的F2群體，有利于多態(tài)性標(biāo)記的開發(fā)，通過高通量測序和覆蓋全基因組標(biāo)記的檢測，從43 528 021個測序片段中獲得了 6 353 個多態(tài)性 SNP 標(biāo)記，其中，5 829 個標(biāo)記成功分型，在這些分型的標(biāo)記中又精選出2 246個有效的 SNP 標(biāo)記，可應(yīng)用于進(jìn)一步的圖譜構(gòu)建。

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