岳曉雪 苗勁蔚 路攀

[摘要] 目的 探討miR21影響宮頸癌細(xì)胞株Hela及順鉑耐藥細(xì)胞株Hela/DDP順鉑敏感性的分子機(jī)制。 方法 利用riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑分別將成熟miR21 mimic及其陰性對照試劑NC轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，miR21 inhibitor及其陰性對照試劑NC轉(zhuǎn)染至Hela/DDP細(xì)胞，并將細(xì)胞分為mimic組、inhibitor組、相應(yīng)NC組及Blank組。Real-time PCR檢測PTEN mRNA的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期（PI法）及經(jīng)順鉑處理后的凋亡率（AnnexinⅤ/PI法）。 結(jié)果 Real-time PCR法檢測PTEN mRNA在Hela/DDP中低表達(dá)，為Hela的（0.410±0.046）倍（P < 0.01）；轉(zhuǎn)染mimic后，Hela中PTEN mRNA表達(dá)明顯低于NC組及Blank組（P < 0.01），NC組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；轉(zhuǎn)染inhibitor后，Hela/DDP中miR21表達(dá)明顯高于NC組及Blank組（P < 0.01），NC組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。AnnexinⅤ/PI檢測結(jié)果顯示，mimic組凋亡率與NC組、Blank組比較明顯減少（P < 0.05），inhibitor組凋亡率與NC組、Blank組比較顯著提高（P < 0.05）。PI法檢測結(jié)果顯示，mimic組S期所占比例與NC組、Blank組比較明顯增加（P < 0.05），NC組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；inhibitor組S期所占比例與NC組、Blank組比較明顯減少（P < 0.05），NC組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 PTEN mRNA在Hela/DDP中低表達(dá)，在Hela中高表達(dá)。上調(diào)miR21在Hela中的表達(dá)能明顯降低PTEN mRNA的表達(dá)，減少凋亡，增加細(xì)胞周期中S期所占比例，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥；下調(diào)miR21在Hela/DDP中的表達(dá)能明顯增加PTEN mRNA的表達(dá)，增加凋亡率，降低細(xì)胞周期中S期所占比例，從而達(dá)到增加化療敏感性的效果。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌細(xì)胞；宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞；miR21；PTEN；順鉑；化療敏感性

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（c）-0013-06

Study on the mechanism of Cisplatin chemosensitivity in cervical cancer cells based on miR21

YUE Xiaoxue MIAO Jinwei LU Pan

Department of Gynecological Oncology， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100006， China

[Abstract] Objective To detect the mechanism of miR21 gene on the sensitivity of Hela and Cisplatin-resistant Hela/DDP cells to Cisplatin. Methods Mature miR21 mimic and negative control （NC） miRNA were transfected into Hela cells， while miR21 inhibitor and negative control （NC） miRNA were transfected into Hela/DDP cells by riboFECTTM CP. Therefore， Hela cells were divided into mimic group， inhibitor group， NC group and blank group. Real-time PCR was used to measure the expression of PTEN mRNA in each group. The cell cycle was measured through PI method and apoptosis rate of cells after Cisplatin treatment was detected through AnnexinⅤ/PI by fluorescene activated cell sorter. Results Real-time PCR results showed that the expression of PTEN mRNA was an average of （0.410±0.046） fold higher in Hela/DDP than in Hela （P < 0.01）. The expression of PTEN mRNA in mimic group was obviously lower than those in NC group and blank group （P < 0.01）. The expression of PTEN mRNA in inhibitor group was significantly higher than those in NC group and blank group （P < 0.01）. There was no statistical difference between NC group and blank group （P > 0.05） in Hela and Hela/DDP cells. The results of Annexin Ⅴ/PI showed that the apoptosis rate of mimic group was lower than NC group and blank group （P < 0.05）， while the inhibitor group showed that the apoptosis rate was more than NC group and blank group （P < 0.05）. The of cell proportion of S period in mimic group was higher than those of NC group and blank group （P < 0.05）， and there was no significant difference between NC group and blank group （P > 0.05）. In the meantime， the cell proportion of S period in inhibitor group was less than those of NC group and blank group （P < 0.05）， and there was no significant difference between NC group and blank group （P > 0.05）. Conclusion PTEN mRNA is low expressed in Hela/DDP cells and highly expressed in Hela cells. The up-regulated expression of miR21 in Hela can significantly reduce the expression of PTEN mRNA， reduce apoptosis and increase the proportion of S phase in the cell cycle， thereby resulting in Cisplatin resistance. The down-regulated expression of miR21 in Hela/DDP can increase the expression of PTEN mRNA， increase the apoptosis rate and reduce the proportion of S phase in the cell cycle， so as to increase the chemosensitivity of Cisplatin.

[Key words] Hela； Hela/DDP； miR21； PTEN； Cisplatin； Cheosensitivity

宮頸癌在我國女性惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅婦女健康[1]。化療是許多惡性腫瘤的主要治療手段，但在宮頸癌中目前僅作為術(shù)前新輔助治療或晚期復(fù)發(fā)的姑息性治療。化療在宮頸癌應(yīng)用中受到限制的主要原因是化療耐藥[2]。因此闡明宮頸癌化療耐藥的分子機(jī)制，逆轉(zhuǎn)化療耐藥對中晚期宮頸癌患者預(yù)后意義重大。微小RNA（microRNAs）的發(fā)現(xiàn)為攻克腫瘤化療難題開啟了一條新的途徑。microRNAs是一類單鏈非編碼的微小RNA，長度為21～23個核苷酸，通過調(diào)控不同的靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性方面發(fā)揮重要作用[3-4]。研究表明，多種腫瘤中都存在著miR21高表達(dá)的現(xiàn)象，并且與腫瘤耐藥相關(guān)[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR21在Hela細(xì)胞中的表達(dá)能明顯降低其對順鉑的敏感性，下調(diào)miR21在Hela/DDP細(xì)胞中的表達(dá)能明顯增加其對順鉑的敏感性[7]，但其作用機(jī)制仍不清楚，故本研究通過對細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染外源性改變miR21的表達(dá)水平，進(jìn)一步探索miR21影響宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株Hela/DDP購自北那生物（BNCC 338278），宮頸癌親本細(xì)胞株Hela由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所惠贈。順鉑（10 mg/支）購自山東齊魯制藥有限公司（批號：H37021358）。DMEM、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自南京凱基生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI apoptosis Kit（AP101-60）及Cell Cycle Staining Kit（CCS012）購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自康為世紀(jì)生物公司；miR21mimic、mimic negative control（NC）、inhibitor、inhibitor negative control（NC）及轉(zhuǎn)染試劑riboFECTTM CP（RN：R10034.6）購自銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela、Hela/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中（5%CO2、37℃），胰酶常規(guī)消化、傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用riboFECTTM CP分別轉(zhuǎn)染mimic、inhibitor和陰性對照試劑。mimic組轉(zhuǎn)染50 nmol mimic，inhibitor組轉(zhuǎn)染100 nmol inhibitor，NC組分別轉(zhuǎn)染mimic NC、inhibitor NC，Blank組不做任何轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 Real-time PCR檢測PTEN mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）：（2X）SYBR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL；（50X）ROX Reference Dye 0.5 μL；cDNA模板各2 μL，ddH2O 5.5 μL。以GAPDH為內(nèi)參。PTEN基因引物序列，上游5′-GAGCGTGCAGATAATGACAAGGAAT-3′，下游5′-GGATTTGACGGCTCCTCTACTGTTT-3′。GA？鄄PDH基因引物序列，上游5′-GTCAAGGCTGAGAAC？鄄GGGAA-3′，下游5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min變性；95℃ 10 s，59℃ 60 s（40個循環(huán)）富集目標(biāo)miRNA；95℃，15 s，72℃，15 s，95℃，15 s退火延伸。所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔。Ct值（2-ΔΔCt）公式對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。ΔΔCt=（CtPTEN-CtGAPDH）轉(zhuǎn)染組-（CtPTEN-CtGAPDH）對照組。

1.2.4 AnnexinⅤ/PI法檢測凋亡 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將終濃度為5 μg/mL順鉑加入Hela細(xì)胞中，終濃度為30 μg/mL順鉑加入Hela/DDP細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后消化細(xì)胞，PBS（4℃）洗滌細(xì)胞2次；加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞；每管加入5 μL AnnexinⅤ-FITC、10 μL PI試劑染色，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min；流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.5 PI法檢測細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加 1 mL DNA Staining solution和10 μL Permeabilization solution，振蕩10 s，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Graphad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hela與Hela/DDP細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)

Real-time PCR法檢測Hela/DDP與Hela細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，結(jié)果顯示PTEN mRNA在Hela/DDP與Hela中表達(dá)量分別為（0.425±0.040）、（1.040±0.043），前者是后者的（0.410±0.046）倍，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)染mimic或inhibitor后PTEN mRNA表達(dá)的變化

2.2.1 Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic后PTEN mRNA的表達(dá) Real-time PCR檢測Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic（50 nm）后PTEN mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示mimic組表達(dá)明顯減低，表達(dá)量為（0.371±0.004），與NC組（1.038±0.002）及Blank組（1.040±0.043）比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），NC組及Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖2A）。

2.2.2 Hela/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor后PTEN mRNA的表達(dá) Real-time PCR檢測Hela/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor（100 nm）后PTEN mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示inhibitor組表達(dá)顯著增加，表達(dá)量為（1.769±0.063），與NC組（0.353±0.009）及Blank組（0.425±0.040）比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），NC組及Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖2B）。

2.3 轉(zhuǎn)染mimic或inhibitor后細(xì)胞凋亡率的變化

2.3.1 Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic后凋亡率變化 Hela轉(zhuǎn)染mimic、NC 24 h后加5 μg/mL順鉑培養(yǎng)48 h后，AnnexinⅤ/PI法檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示mimic組凋亡率為（19.850±2.150）%，與NC組[（27.250±0.150）%]及Blank組[（31.050±0.939）%]比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖3A）。

2.3.2 Hela/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor后凋亡率變化 Hela/DDP轉(zhuǎn)染inhibitor，NC 24 h后加30 μg/mL順鉑培養(yǎng)48 h后，AnnexinⅤ/PI法檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示inhibitor組凋亡率為（95.200±0.356）%，與NC組[（61.150±0.950）%]及Blank組[（54.700±4.100）%]比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖3B）。

2.4 轉(zhuǎn)染mimic或inhibitor后細(xì)胞周期的變化

2.4.1 Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic后周期變化 Hela轉(zhuǎn)染mimic、NC后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，流式檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果為mimic組S期所占比例為（36.383±1.339）%，與NC組[（24.160±0.490）%]及Blank組[（23.770±0.792）%]比較顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），NC組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖4A）。

2.4.2 Hela/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor后周期變化 Hela/DDP轉(zhuǎn)染inhibitor、NC后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，流式檢測細(xì)胞周期，結(jié)果為inhibitor組S期所占比例為（28.410±0.270）%，與NC組[（33.330±2.582）%]及Blank組[（32.883±1.097）%]比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），NC組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖4B）。

3 討論

研究表明，miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，其中miR21最受關(guān)注。miR21是唯一一個幾乎在所有實(shí)體腫瘤和非實(shí)體腫瘤中均高表達(dá)的微小RNA[9-14]，如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤等，在人類miRNA功能學(xué)研究中占有重要地位。Bertino等[15]提出通過分析miRNA的異常表達(dá)在改變患者對藥物的敏感性中的作用機(jī)制進(jìn)而發(fā)現(xiàn)某些可用于指導(dǎo)個性化用藥的特殊“miRNA”，即“miRNA的藥物基因組學(xué)”的想法?；诖?，學(xué)者們?nèi)找骊P(guān)注miR21在腫瘤耐藥方面發(fā)揮的作用，Chan等[16]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系中，下調(diào)miR21的表達(dá)可增加順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞對順鉑的敏感性。在膀胱癌T24細(xì)胞株中，上調(diào)miR21的表達(dá)可以誘導(dǎo)多柔比星化療耐藥，下調(diào)miR21的表達(dá)可以增加T24細(xì)胞對多柔比星的敏感性[17]。下調(diào)miR21的表達(dá)可以增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對依托泊苷的敏感性[16]，研究人員同樣發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中miR21也發(fā)揮類似的作用[18]。越來越多的研究結(jié)果提示，多種腫瘤化療耐藥與miR21關(guān)系密切，然而關(guān)于其作用機(jī)制的報道目前較少。

miRNA通過下游靶基因介導(dǎo)參與裂解靶基因或抑制翻譯，因此通過靶基因預(yù)測分析網(wǎng)站如“http：//pictar.mdc-berlin.de/”“http：//mirdb.org/miRDB/”及“http：//www.targetscan.org/”等對miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測[19]，可間接判斷其在這些過程中扮演的角色。在miRNA眾多的靶基因中目前只有少數(shù)得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，包括PTEN、PDCD4、TPMI及TIMP等[10]。熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR21可與PTEN基因的3′UTR結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因表達(dá)[8]，這為我們進(jìn)一步研究miR21在宮頸癌耐藥中的分子機(jī)制提供依據(jù)。

結(jié)合本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，PTEN mRNA在Hela/DDP中低表達(dá)，而miR21在Hela/DDP細(xì)胞中的高表達(dá)誘導(dǎo)了宮頸癌的順鉑耐藥，這提示PTEN可能與miR21誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞耐藥有關(guān)，生物學(xué)信息分析軟件靶基因預(yù)測結(jié)果提示PTEN為miR21的靶基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR21 mimic后PTEN mRNA表達(dá)明顯減少，而Hela/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR21 inhibitor后PTEN mRNA表達(dá)明顯增加，更加證明了miR21通過PTEN相關(guān)通路影響細(xì)胞的藥物敏感性。即上調(diào)miR21在Hela細(xì)胞中的表達(dá)可降低PTEN mRNA表達(dá)，減少凋亡，增加細(xì)胞周期中S期所占比例，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。下調(diào)miR21在Hela/DDP細(xì)胞中的表達(dá)能增加PTEN mRNA表達(dá)，增加凋亡，降低細(xì)胞周期中S期所占比例，從而達(dá)到化療增敏的效果。

綜上所述，本研究推測miR21在宮頸癌細(xì)胞中可能通過調(diào)節(jié)PTEN相關(guān)通路，減少細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯在S期從而順鉑耐藥，這可能有助于增加臨床對宮頸癌化療不敏感的分子機(jī)制的了解，研發(fā)新的增加宮頸癌化療敏感性的靶點(diǎn)，但關(guān)于miR21對PTEN蛋白表達(dá)的影響及其是否僅通過調(diào)控PTEN進(jìn)而影響化療敏感性尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-11-25 本文編輯：張瑜杰）