王 吉, 付 瑞, 李曉波, 王淑菁, 王莎莎, 李 威, 秦 驍, 鞏 薇, 岳秉飛, 賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物遺傳檢測(cè)中心, 北京 100050)

牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type3, BPIV3) 屬副黏病毒科(paramyxoviridae)副黏病毒亞科(paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(respirovirus)成員，為單鏈負(fù)股有囊膜的RNA病毒[1]。1959年Reisinger等[2]和Hoerlein等[3]在美國(guó)的牛體中首次分離到BPIV3，同時(shí)在這些動(dòng)物中查出了該病毒的抗體[2-4]。目前，BPIV3廣泛流行于世界各國(guó)，在美洲、歐洲、亞洲各國(guó)均不斷發(fā)生或流行[4]。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示BPIV3在我國(guó)流行比較廣泛[4]。以支氣管炎、肺炎等呼吸道癥狀為主要特征[4,5]。嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。同時(shí)BPIV3也是一種重要的人獸共患病毒[1]，不僅對(duì)飼養(yǎng)人員造成威脅，而且通過(guò)潛在污染人用牛源性產(chǎn)品對(duì)人民用藥安全造成潛在威脅。

隨著生物醫(yī)藥生產(chǎn)技術(shù)的迅猛發(fā)展，動(dòng)物源性生物制品的開(kāi)發(fā)利用日益增多，尤其是牛源產(chǎn)品及副產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，同時(shí)伴隨著科技及對(duì)藥品生物制品質(zhì)量發(fā)展的要求，人們對(duì)牛源性制品是否攜帶或潛在病毒污染，尤其是可直接對(duì)人民用藥安全造成威脅的人獸共患病毒越來(lái)越關(guān)注。為保障人民用藥安全及避免傳染病的擴(kuò)散，最大限度地降低使用牛源性產(chǎn)品傳播牛攜帶BPIV3的風(fēng)險(xiǎn),本實(shí)驗(yàn)建立了快速、特異、敏感的BPIV3 RT- PCR方法，用于對(duì)牛及人用牛源性制品及原材料可能攜帶或潛在BPIV3 的檢測(cè)，對(duì)保證牛源材料及牛源產(chǎn)品的使用安全性、保障人民用藥安全非常重要。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品

BPIV3、傳染性牛鼻氣管炎病毒(bovine herpesvirus type 1, BHV-1)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 (ATCC)(編號(hào)分別為VR-281、VR-188、VR-1422); 仙臺(tái)病毒(Sendai virus，SV)由本室保存;12批次小牛血清去蛋白注射液和脾多肽注射液(編號(hào)NY1～NY12)由國(guó)內(nèi)3個(gè)廠家提供，64份牛血漿樣本(編號(hào)分別為X1～X61)由北京某單位提供，61份牛鼻拭子樣本(編號(hào)分別為b1～b61)由內(nèi)蒙古自治區(qū)某單位提供。

1.2 主要試劑

DNA/RNA快速提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司; Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購(gòu)自日本TaKaRa公司; PCR儀和核酸瓊脂糖凝膠電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司(PwerPac Basic); 凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)Kodak公司(GL212Pro)。

1. 3 引物設(shè)計(jì)及合成

分析已報(bào)道的BPIV3序列，選擇神經(jīng)氨酸酶(HN)基因保守區(qū)域作為靶基因。根據(jù)GenBank中登陸的BPIV3HN基因(序列號(hào): AF178655.1)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2組引物(表1)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表 1 用于擴(kuò)增HN2基因的引物序列及位置Table 1 Used for amplification HN2 gene primer sequence and position

1.4 病毒DNA提取

對(duì)正常牛腎細(xì)胞(bovine kidney cells，MDBK細(xì)胞)、BPIV3感染MDBK細(xì)胞毒、BVDV、BHV-1、SV，按照DNA/RNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行DNA/RNA提取。提取的DNA樣本凍存于-70 ℃冰箱備用。提取的RNA樣本立即進(jìn)行cDNA合成。

1.5 PCR檢測(cè)方法的建立及引物的篩選

以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)2組引物PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、10×Buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量、及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)正常MDBK細(xì)胞、BPIV3感染MDBK細(xì)胞毒的進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)確定PCR反應(yīng)的最佳模式及最佳引物。

1.6 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE(0.04 mol/L Tris乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH8.0)，110 V電泳30 min，在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder Marker為參照物，判定結(jié)果。PCR陽(yáng)性擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)與Genbank 中BPIV3序列進(jìn)行比對(duì)以確定PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性[7]。

1.7 特異性的試驗(yàn)

在方法建立及最佳引物篩選的基礎(chǔ)上，分別以BPIV3感染MDBK細(xì)胞毒、BVDV、BHV-1、 SV及正常MDBK細(xì)胞的DNA/cDNA為模板，用篩選出的最佳引物2(HN2)建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.8 敏感性的試驗(yàn)

取感染滴度為6.5 lgTCID50/mL BPIV3病毒液，用PBS做10倍梯度稀釋?zhuān)衷O(shè)原液到10-6共7個(gè)稀釋度。取每個(gè)稀釋度病毒液各0.2 mL制備模板，用引物2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測(cè)病毒最小滴度[7]。

1.9 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取10-3～10-5BPIV3 cDNA及同一批PCR檢測(cè)試劑在-30 ℃冰箱放置12個(gè)月時(shí)，用引物2進(jìn)行PCR檢測(cè)，每個(gè)稀釋梯度cDNA各做3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定[7]。

1.10 應(yīng)用

取12份牛源性制品樣本(12份小牛血清去蛋白注射液和脾多肽注射液樣本編號(hào): NY1～NY12)、64份牛血漿樣本(編號(hào): X1～X64)、61份牛鼻拭子樣本(編號(hào): b1～b61)、及正常MDBK細(xì)胞與BPIV3同時(shí)提取RNA, 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 用引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

擴(kuò)增到的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank中BPIV3核酸序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)方法的建立

2.1.1 最佳反應(yīng)條件的確定 通過(guò)對(duì)2組引物PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應(yīng)體系為: 10 × ExTaq Buffer(含 Mg2+) 2 μL, dNTPs Mixture(10 mmol/L) 2 μL, Taq HS酶(5 U/μL) 0.5 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各 1 μL, DNA 2 μL，補(bǔ)水至20 μL; PCR最佳反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 共35個(gè)循環(huán); 72 ℃再延伸5 min。

2.1.2 最佳引物的確定 2組引物以BPIV3為模板進(jìn)行擴(kuò)增，HN1和HN2引物均有明顯目的條帶出現(xiàn)，但HN2較HN1擴(kuò)增效果更好(圖1)，因此選擇HN2引物建立RT-PCR檢測(cè)方法。

2.2 方法的特異性實(shí)驗(yàn)

HN2引物特異性實(shí)驗(yàn)顯示以BPIV3 cDNA為模版有明顯的目的條帶出現(xiàn)，以BVDV、BHV-1、SV及正常MDBK細(xì)胞的DNA/cDNA為模板，均無(wú)目的條帶出現(xiàn)(圖2)。

2.3 方法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

選擇引物2 PCR擴(kuò)增BPIV3陽(yáng)性片段進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析, 與GenBank中BPIV3核酸序列同源性為99%, 說(shuō)明該方法檢測(cè)準(zhǔn)確性較好(圖3)。

圖 1 引物篩選結(jié)果Figure 1 The results of primers screening

圖 2 引物2 特異性條件驗(yàn)證Figure 2 Specific validation results of primer 2

圖 3 引物2 PCR擴(kuò)增BPIV3陽(yáng)性片斷與GenBank中BPIV3毒株序列比對(duì)結(jié)果Figure 3 The comparison results of primer 2 PCR BPIV3 positive amplification fragment with BPIV3 in GenBank

2.4 方法敏感性試驗(yàn)

通過(guò)圖4敏感性結(jié)果顯示，引物2檢測(cè)病毒滴度均可以達(dá)到6 lgTCID50/mL。

2.5 方法穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

電泳結(jié)果顯示, 10-3～10-5BPIV3 cDNA 在-30 ℃冰箱放置12個(gè)月時(shí)，用引物2進(jìn)行檢測(cè)，仍能擴(kuò)增出約610 bp明顯可見(jiàn)目的條帶(圖5)。

圖 4 引物2 PCR檢測(cè)敏感性測(cè)定-BPIV3細(xì)胞毒濃度梯度Figure 4 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 2-cytotoxic concentration gradient of BPIV3

圖 5 引物2 PCR穩(wěn)定性測(cè)定Figure 5 The repeatability and stability testing results of PCR using primers 2

2.6 初步應(yīng)用

2.6.1 牛血漿檢測(cè) 利用引物2建立的PCR檢測(cè)方法, 對(duì)64 份牛血漿樣本(編號(hào): X1～X64)進(jìn)行檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示有11份樣本(編號(hào)為: X4、X6、X8、X13、X19、X20、X29、X35、X40、X42、X62)擴(kuò)增到約610 bp的可見(jiàn)目的條帶, 其他53份牛血漿樣本均未擴(kuò)增到可見(jiàn)目的條帶(圖6～圖8)。

圖 6 PCR方法檢測(cè)21份牛血漿樣本(X1～X21)電泳結(jié)果Figure 6 The results of Primers 2 PCR to detect 21 bovine plasma samples (X1～X21)

圖 7 PCR方法檢測(cè)22份牛血漿樣本 (X22～X43) 電泳結(jié)果Figure 7 The results of Primers 2 PCR to detect 22 bovine plasma samples (X22～X43)

2.6.2 牛鼻拭子檢測(cè) 利用引物2建立的PCR檢測(cè)方法, 對(duì)61 份牛鼻拭子樣本(編號(hào)分別為b1～b61)進(jìn)行檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示, 有9份牛鼻拭子樣本(編號(hào)為: b7、b10、b16、b44、b51、b53、58、b59、b60)擴(kuò)增到約610 bp的可見(jiàn)目的條帶; 其他52份牛牛鼻拭子樣本均未擴(kuò)增到可見(jiàn)目的條帶(圖9、圖10)。b22～b40檢測(cè)結(jié)果均為陰性(電泳結(jié)果圖略)。

2.6.3 牛源性制品檢測(cè) 利用引物2建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)12份牛源成品樣本(樣本編號(hào): NY1～NY12)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性(電泳結(jié)果圖略)。

2.6.4 檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證 將BPIV3核酸檢測(cè)陽(yáng)性的樣本 X4、X6、X8、X13、X19、X20、X29、X35、X40、X42、X62和b7、b10、b16、b44、b51、b53、58、b59、b60擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，與GenBank中BPIV3標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性均在95% 以上。檢測(cè)137份樣本BPIV3核酸陽(yáng)性率為14.6%。

3 討論

圖 8 PCR方法檢測(cè)21份牛血漿樣本 (X44～X64) 電泳結(jié)果Figure 8 The results of Primers 2 PCR to detect 22 bovine plasma samples (X22～X43)

圖 9 PCR方法檢測(cè)21份牛鼻拭子樣本(b1～b21)電泳結(jié)果Figure 9 The results of primers 2 PCR to detect 21 bovine nasal secretions samples (b1～b21)

圖 10 PCR方法檢測(cè)21份牛鼻拭子樣本 (b41～b61) 電泳結(jié)果Figure 10 The results of primers 2 PCR to detect 21 bovine nasal secretions samples (b41～b61)

BPIV3作為一種接觸性人獸共患病毒[5,7], 是構(gòu)成牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease complex,BRDc)的主要病毒[8]。不僅感染人和牛，同時(shí)還可感染豬、駱駝等動(dòng)物[9,10]。雖然目前國(guó)內(nèi)外已有BPIV3 PCR檢測(cè)方法建立的報(bào)道[11-13]，但均沒(méi)有推廣應(yīng)用, 尤其是針對(duì)牛源產(chǎn)品及原輔材料外源BPIV3的檢測(cè)還未有報(bào)道。中華人民共和國(guó)藥典亦沒(méi)有關(guān)于牛源制品及原輔材料檢測(cè)的規(guī)定[14]。藥典在“新生小牛血清檢測(cè)”中雖然有關(guān)于新生牛血清用細(xì)胞接種法和免疫熒光法檢測(cè)病毒的規(guī)定[14], 但沒(méi)有更為敏感特異的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，針對(duì)人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的檢測(cè)還是空白。

本研究檢測(cè)了國(guó)內(nèi)5個(gè)廠家牛源性樣本(包括小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液、牛血漿、牛鼻拭子等)137批次。其中檢測(cè)國(guó)內(nèi)3個(gè)廠家小牛血清去蛋白注射液12批次，結(jié)果均為陰性;檢測(cè)北京某單位64份牛血漿樣本陽(yáng)性率為17.2%(11/64); 檢測(cè)內(nèi)蒙古自治區(qū)某單位61份牛血漿樣本陽(yáng)性率為14.8%(9/61); 感染率與文獻(xiàn)報(bào)道相符[15,16]。137批次樣本BPIV3核酸檢出率為14.6%。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)可見(jiàn)的特異性目的條帶進(jìn)行純化測(cè)序，證明20個(gè)有可見(jiàn)目的條帶的樣本為BPIV3。這也充分顯示了普通PCR在結(jié)果確認(rèn)上可以通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的優(yōu)點(diǎn)。從檢測(cè)結(jié)果看，牛源材料樣本中確實(shí)攜帶BPIV3，對(duì)人用牛源性制品構(gòu)成潛在的危險(xiǎn)。

為了保障用藥的安全, 最大限度地降低使用牛源性生物制品傳播牛攜帶相關(guān)病毒的風(fēng)險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)室建立了特異、敏感、操作簡(jiǎn)單的RT-PCR方法,用于牛、人用牛源性生物制品以及用于生產(chǎn)牛源制品的原材料，如牛血漿、牛組織、牛源細(xì)胞等攜帶或潛在污染BPIV3的檢測(cè), 不僅完善了BPIV3的檢測(cè)技術(shù), 為研發(fā)BPIV3 RT-PCR檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ), 也為今后制定相關(guān)技術(shù)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及藥典的完善、在全國(guó)范圍內(nèi)推動(dòng)牛源制品生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)展牛源制品及原輔材料BVDV檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

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