彭麗娜，王朝霞

(上海交通大學實驗動物中心, 上海 200240)

隨著生命科學研究不斷深入，實驗動物已成為高校進行科學研究和教學實驗的重要支撐條件。所有生命科學領(lǐng)域的科研、教學、檢定、安全評價和成果評定都離不開動物實驗[1]。隨著實驗動物在高校的廣泛應用，高校實驗動物機構(gòu)對屏障設(shè)施和實驗動物健康狀況要求也越來越高，各地高校實驗動物機構(gòu)逐步重視動物微生物監(jiān)控程序的建設(shè)。實驗動物的健康狀況會影響到其在科研中的使用，對科研本身、人類健康和實驗動物種群都有可能造成影響。實驗動物健康管理的一個首要目標就是要確定種群中存在或者不存在某些特定的病原體，所以健康監(jiān)控有時可稱為微生物監(jiān)控[2]。上海交通大學實驗動物中心(閔行校區(qū))是校級實驗動物科研平臺，具有上海市實驗動物使用許可。中心致力于校優(yōu)質(zhì)服務平臺的建設(shè), 已成為支撐學校生、農(nóng)、醫(yī)、藥等科研發(fā)展的重要動物實驗基地。本文以上海交通大學實驗動物中心屏障設(shè)施為研究對象，對實驗動物微生物監(jiān)控管理加以討論，以期對高校實驗動物屏障設(shè)施微生物監(jiān)控管理提供借鑒。

1 環(huán)境質(zhì)量控制

1.1 實驗動物屏障設(shè)施的消毒

實驗動物屏障設(shè)施的消毒是維持設(shè)施內(nèi)部清潔，不受微生物污染的必要措施。高校動物屏障設(shè)施由于實驗人員復雜性、流動性大、設(shè)施使用頻繁和操作時間的不確定性等因素，大大增加了設(shè)施內(nèi)部環(huán)境微生物污染的機會，因此消毒工作更加嚴峻。屏障系統(tǒng)在啟用前或者受到污染后重新啟用都需要對其進行徹底消毒。啟用后隨著實驗動物飼養(yǎng)數(shù)量的增加和實驗人員的頻繁進出，設(shè)施內(nèi)的微生物數(shù)量也會不斷增加，因此還要對屏障系統(tǒng)進行常規(guī)的維持性消毒[3]。設(shè)施重新啟用前首先對房間進行前期處理，如關(guān)閉送風口和排風口；清空房間或者將房間內(nèi)籠架、儀器設(shè)備等物品先消毒；最后用過氧化氫滅菌器按照《過氧化氫滅菌器的標準操作規(guī)程》對屏障設(shè)施進行滅菌消毒。高校屏障設(shè)施的維持性消毒應注重消毒劑的選擇，對消毒能力、消毒作用時間、消毒頻率要求較高。通過對多種消毒劑不同使用濃度的消毒效果、消毒作用時間及其穩(wěn)定性、安全性能的比對測試，選用季銨鹽類(0.5%百衛(wèi)士消毒液)、含氯消毒劑(0.03%過氧乙酸消毒液)以及聚六亞甲基雙胍類(1%聚潔消毒液)三種消毒劑進行每周交替輪流使用。根據(jù)不同區(qū)域和設(shè)施對微生物的控制要求以及人員使用的頻率，按照次、日、周、月、季度的消毒頻率，采用滅菌、化學和物理等多種消毒方法相結(jié)合的消毒方式，來保障屏障內(nèi)環(huán)境質(zhì)量安全。具體做法如表1。

表 1 屏障設(shè)施清潔及消毒頻率

1.2 進入屏障內(nèi)物品和動物的消毒

屏障設(shè)施內(nèi)的物品根據(jù)其功能主要劃分為飼養(yǎng)物品和實驗物品。高校屏障設(shè)施內(nèi)由于各課題組使用實驗物品種類繁多, 依據(jù)各類物品的性狀, 需要采取多種消毒方式來保障物品性狀及消毒效果。對物品的消毒主要采用三種消毒方式: (1) 高壓蒸汽滅菌方法。所有能耐高壓滅菌的物品均采用高壓蒸汽滅菌(121℃, 20～30 min)的方式進入屏障系統(tǒng)。(2) 化學消毒方法。主要針對一些不耐高溫、高壓的物品如注射器; 具有生物活性的物品如實驗動物、抗體、細胞、蛋白制劑; 以及經(jīng)60Co輻照滅菌后的飼料等。高校課題組使用的化學試劑、生物試劑種類繁多，在傳入屏障時需要確保其生物活性和化學性狀不受影響。動物的飼料和部分實驗用品經(jīng)高壓滅菌后會破壞其營養(yǎng)成分和性狀，因此對這些物品或?qū)嶒瀯游锏耐獍b表面采用化學消毒方式，通過擦拭、浸泡和噴霧消毒并配合紫外線照射后經(jīng)傳遞窗傳入屏障設(shè)施。物品傳遞和動物傳遞窗對傳遞物品的表面消毒要求較高，需要達到消毒時間短、腐蝕性小、消毒效果強的效果，因此主要采用1%百衛(wèi)士(第四代季銨鹽技術(shù)和配方，輔以協(xié)同增效的高效清潔劑，使殺菌和清潔雙效合一)消毒品進行消毒。(3)物理消毒方法。高校課題組的一些特殊小型儀器，如眼壓儀、游標卡尺等容易受化學消毒品腐蝕而影響其精密度，因此這些物品經(jīng)表面除塵后采用75%的酒精擦拭和紫外線照射的方法通過傳遞窗傳入屏障。另外屏障設(shè)施內(nèi)的一些大型的儀器設(shè)備，如IVC籠架，超凈臺，實驗儀器等，因體型較大不能通過物品傳遞窗傳遞。主要通過外表面除塵、常規(guī)消毒品或者75%酒精擦拭消毒以及經(jīng)過物品出口緩沖間延長紫外照射(2 h)的方式傳入屏障設(shè)施內(nèi)(表2)。

表2 進入屏障設(shè)施內(nèi)物品及動物的消毒方式

1.3 質(zhì)控管理

定期對屏障設(shè)施內(nèi)環(huán)境及物品的消毒、滅菌效果進行微生物監(jiān)測，是保障屏障設(shè)施內(nèi)環(huán)境安全的重要舉措。如每月對屏障設(shè)施內(nèi)空氣落下菌、各區(qū)域環(huán)境衛(wèi)生、飼養(yǎng)物品(墊料、飼料、飲水、籠具)及實驗用品按照標準操作流程(SOP)進行微生物檢測。如檢出個別位置空氣落下菌或者環(huán)境衛(wèi)生不合格，則加強消毒，如不合格的位置較多則考慮更換高效過濾器或者消毒品。如屏障內(nèi)使用的是84消毒液，因其需要作用的時間較長且經(jīng)長期使用后微生物會產(chǎn)生耐藥性，若發(fā)現(xiàn)空氣落下菌檢出率增加，提示其消毒效果降低，在實際工作中，我們將消毒液更換為聚潔消毒液后空氣落下菌的檢出率就大大降低，保障了屏障設(shè)施內(nèi)環(huán)境質(zhì)量安全。物品如檢出不合格則直接淘汰，經(jīng)重新消毒或高壓滅菌后方可繼續(xù)使用。另外高校課題組實驗人員攜入的外來實驗用品種類較多且使用頻繁，通過采用儲物柜分類儲存并定期清理和部分公共物品中心內(nèi)部提供相結(jié)合的管理方式，來預防和降低實驗物品頻繁進出或延期使用造成的污染風險。

2 動物質(zhì)量控制

2.1 動物來源把控

安全、可靠的動物來源是高校實驗動物健康監(jiān)測管理的源頭和質(zhì)量保障, 《實驗動物管理條例》[4]規(guī)定: “對引入的實驗動物, 必須進行隔離檢疫”。目前就嚙齒類動物而言，基因修飾小鼠是病原微生物攜帶的高危群體。隨著科研能力的增強，現(xiàn)在越來越多的轉(zhuǎn)基因小鼠出自某一科研團隊的實驗室而非生產(chǎn)單位, 從而導致微生物控制水平參差不齊, 伴隨這類動物在不同機構(gòu)之間的輸出流轉(zhuǎn),安全隱患不言而喻。高校科研人員具有多學科、多方向的科研性質(zhì), 使其通過各種渠道獲得動物的頻率和種類更加龐雜，因而動物隔離檢疫和隔離觀察就顯得尤為重要，特別是動物來自不明健康等級的供應者或?qū)嶒炇視r，更需要嚴格的防疫管理程序。

因此優(yōu)先采用統(tǒng)一訂購的方式引進實驗動物，并制定《國內(nèi)新進實驗動物管理規(guī)定》和《進境實驗動物管理規(guī)定》來保障實驗動物引入安全。動物來源必須是經(jīng)過資質(zhì)認可的供應商，并進行定期抽檢，以監(jiān)督所供應動物的質(zhì)量和穩(wěn)定性。從非認可機構(gòu)引進的動物，須進行隔離觀察和隔離檢疫，待動物送檢合格后可轉(zhuǎn)為正常飼養(yǎng)。如檢測不合格，一律進行生物凈化。

2.2 動物健康監(jiān)測方案的制定

高校實驗動物中心因其服務對象的廣泛化和科學研究的多樣化等特點，制定動物健康監(jiān)測方案時，在考慮國內(nèi)標準的同時也要和國際標準接軌。參照歐洲實驗動物科學聯(lián)合會(FELASA)的解決建議，需要考慮微生物單元、引入有害微生物的風險、監(jiān)測的頻率、樣品數(shù)和哨兵鼠、檢測的方法及要監(jiān)測的病原、檢測報告、方案實施的可行性等諸多因素，應結(jié)合實際情況，制定個性化健康監(jiān)測方案。首先，確定監(jiān)測方案中的相關(guān)責任人，行政主任對整個健康監(jiān)測方案的實施進行決策，獸醫(yī)師或者獸醫(yī)技術(shù)員負責動物樣品的微生物檢測，檢測結(jié)果由總獸醫(yī)師進行判定并制定處理方案，所有文檔由辦公室文員負責存檔保存。其次，根據(jù)所監(jiān)測實驗動物的微生物等級按照相應的國家標準來定期監(jiān)測，如SPF小鼠，每季度送檢并按國家標準進行全部項目檢測。另外參照FELASA的解決建議，針對不同監(jiān)測“單元”的實驗項目根據(jù)其實驗性質(zhì)進行病原體選擇，制定每個監(jiān)測“單元”的病原體排除列表。第三，獸醫(yī)和科研人員及時進行有效溝通和協(xié)商，確定病原體排除計劃，包括監(jiān)測種群的方法、頻率、取樣量等因素。最后由獸醫(yī)根據(jù)實驗研究進展和動物感染程度等，確定感染動物是否需要進行隔離飼養(yǎng)、延長監(jiān)測期、進行生物凈化或者實施安死術(shù)。

2.3 哨兵動物監(jiān)測方法

在某些實驗或生產(chǎn)單位中，由于設(shè)施條件、動物不充足等因素的限制，不能直接抽檢實驗動物，因此采用哨兵動物來實施健康監(jiān)測。高校實驗動物中心因個別課題組委托飼養(yǎng)的實驗動物極其珍貴，受其數(shù)量限制和遺傳修飾等因素的影響，無法隨機抽取動物進行健康監(jiān)測。另外，一些免疫缺陷動物因自身不能產(chǎn)生抗體，傳統(tǒng)的血清學檢測方法并不能反映出封閉環(huán)境內(nèi)實驗動物的感染情況[6]。因此通過設(shè)置哨兵動物來直接或者間接接觸在研實驗動物，能夠在不干擾在研動物實驗的前提下，快速預示病原體的感染狀況，有效地控制病原體的傳播。哨兵動物一般經(jīng)外源引入, 也可以來源于現(xiàn)有的實驗動物種群。哨兵動物可以間接的接觸被監(jiān)測動物的墊料、飲水、飼料等材料，也可以直接放置在被監(jiān)測動物的籠盒內(nèi)。哨兵動物在檢測前需要和被監(jiān)測的實驗動物在相同的飼養(yǎng)條件下至少接觸6周時間，而更長的接觸時間(如10～12周)可能效果更好，因為有些病原如支原體、嗜肺巴斯德桿菌等[5]的感染/血清轉(zhuǎn)化需要更多的時間。

哨兵鼠通常選用3～4周齡雌性ICR小鼠，設(shè)置到籠架的指定位點，一般每面籠架(60籠小鼠)設(shè)置1籠哨兵鼠(每籠2～3只)，或者直接放置在被監(jiān)測的實驗小鼠籠內(nèi)。每周確保哨兵鼠籠里更換來自所監(jiān)測實驗鼠的每一籠更換下來的“臟”墊料，以監(jiān)控實驗用鼠的健康狀態(tài)。每月和每季度通過自檢和送檢相結(jié)合的方式進行監(jiān)測，如該哨兵鼠檢測合格，則籠內(nèi)補設(shè)一只；如檢測不合格，此籠哨兵鼠淘汰并重新設(shè)置。哨兵鼠檢測項目主要包括國家標準中SPF小鼠必檢項目，特殊情況下(如進境動物)增添國外流行且可能對動物實驗造成影響的其他項目，如小鼠諾如病毒、螺旋桿菌等。

2.4 排風道粉塵(EAD)監(jiān)測

從IVC系統(tǒng)中對環(huán)境樣本進行分析是一種比較新的，有前景的方法，可以用來改善實驗動物設(shè)施的健康監(jiān)測。盡管如此，大多數(shù)的健康監(jiān)測項目都是基于哨兵鼠的檢測。患病動物可以用于直接測試，但是許多實驗動物的感染是亞臨床感染并且一些受感染動物的臨床表現(xiàn)并不明顯[5]。哨兵鼠在適當?shù)慕佑|時間后，通過多種方法對其病原體進行檢測，這導致大量的小鼠為了健康監(jiān)測而犧牲。然而，并不是所有的病原體都是通過臟墊料來傳播，如仙臺病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、嗜肺巴斯德桿菌以及鼠皮螨和饒蟲等[7]。

通過臟墊料哨兵鼠來進行動物健康監(jiān)測，雖然仍是實驗動物領(lǐng)域的一項技術(shù)，但因其自身存在多個缺點，這一缺陷可能會導致許多不同的病原體被忽視。研究表明[8-11]，即使在患病率很低的情況下，EAD監(jiān)測方法相比哨兵鼠檢測有很明顯的優(yōu)勢。EAD-PCR主要通過定期收集IVC高效過濾器上的粉塵，對同一監(jiān)測“單元”的粉塵樣品進行合并，通過PCR方法檢測粉塵內(nèi)的各類微生物，達到動物健康監(jiān)測目的。EAD-PCR方法具有對動物無影響、病原檢出率高、操作簡單、成本低等優(yōu)勢，但仍需要哨兵鼠來確認活的微生物(如病毒血清)，因此可作為傳統(tǒng)血清學、細菌學和寄生蟲學檢測方法的替代和補充，是一種可靠的且易于建立的快速檢測方法，將逐步應用到實驗動物的健康監(jiān)測管理中。

2.5 制定病原體排除列表及排除計劃

病原體排除列表是指在某些研究領(lǐng)域的實驗動物種群中不能存在的傳染性病原體微生物的列表。高校實驗動物中心涉及的一些模型動物、免疫缺陷動物、轉(zhuǎn)基因動物較多，因此不同飼養(yǎng)單元內(nèi)不同實驗動物的種類和研究類型可能會有不同的病原體排除列表。

根據(jù)研究者提交的《實驗動物研究計劃》了解設(shè)施里不同飼養(yǎng)單元內(nèi)飼養(yǎng)和使用的動物品種品系及其實驗內(nèi)容。根據(jù)現(xiàn)有品系對某種流行性疾病的流行病學和病理學分析，判斷該病原體對實驗結(jié)果科學性的影響，并根據(jù)不同的病原體排除列表制定相應的排除計劃。例如，在排除列表上的病原體一旦被檢出，對該監(jiān)測單元的實驗動物立即啟動應急預案。對于已明確感染的動物直接實施安死術(shù)，其它可疑動物則根據(jù)檢出的病原體分類級別、傳播速度和動物的死亡率及科研進展程度等因素，采取緊急降級、隔離飼養(yǎng)和生物凈化等多種措施。若檢出的病原體屬于條件性致病菌或者三類病原微生物，因其在應激情況下才有可能導致動物發(fā)病，則主要采取降級處理，即將可疑動物轉(zhuǎn)移至微生物控制級別相對低的設(shè)施；若檢出的病原體有一定傳播性和致病性，則應將可疑動物轉(zhuǎn)移至隔離包內(nèi)進行隔離飼養(yǎng)，并進行生物凈化。對降級飼養(yǎng)的動物實施全面的自檢普查，增加哨兵鼠的設(shè)置數(shù)量和監(jiān)測頻率。對檢出陽性的動物實施安死術(shù)，對檢出陰性的動物繼續(xù)進行跟蹤監(jiān)測，連續(xù)監(jiān)測3次后無陽性病原檢出，則該降級單元轉(zhuǎn)為常規(guī)監(jiān)測飼養(yǎng)。如仍有陽性動物檢出，則需要跟課題組協(xié)商，根據(jù)實驗需要選擇生物凈化或者直接實施安死術(shù)，盡快消滅傳染源。

2.6 動物監(jiān)測頻率

微生物監(jiān)測的頻率需要考慮多方因素，一般不作明確規(guī)定，在節(jié)約資源和檢測到病原體感染的最短時間選擇平衡點[12]。設(shè)施需要考慮所要監(jiān)測的種群的用途、某一或者某些病原對該種群的影響程度、病原侵入的風險及經(jīng)費等。根據(jù)飼養(yǎng)方式的不同，在經(jīng)常引入新動物的設(shè)施，與不常引入新進動物的設(shè)施相比，監(jiān)測頻率應適度提高。一般原則是高頻度的小樣本監(jiān)測(如每4～6周檢測3～5只動物)比低頻度的大樣本監(jiān)測(如3個月監(jiān)測10只動物)更可靠[3]。

參照現(xiàn)行版的《實驗動物微生物等級及監(jiān)測》國家標準，以及針對自身情況擬定的病原體排除列表計劃，并結(jié)合獸醫(yī)巡檢情況來確定屏障內(nèi)的實驗動物健康監(jiān)測頻率。通過送檢每個飼養(yǎng)室的哨兵鼠，對國家標準中規(guī)定必須要排除的病原體進行季度全項檢測。對各個飼養(yǎng)室排除列表上的病原體則采用自檢、送檢相結(jié)合的方式進行，自檢檢測陽性或者疑似陽性項目，送第三方復檢。復檢陽性時，檢測頻率從每季度提升至每月。

3 人員管理

高校實驗動物中心相比其他實驗動物機構(gòu)有一個顯著特點是人員管理的復雜性，由于科研人員的流動性和時間上的不固定性, 在管理上存在難點[13]。高校每年都有較多學生入學和畢業(yè)，人員交替頻繁，尤其畢業(yè)生在完成動物實驗后，實驗動物的交接工作經(jīng)常出現(xiàn)斷檔；教師類科研人員的實驗時間具有不確定性，有時白天要進行教學等工作需在晚上或周末開展實驗，導致對其缺乏有效的監(jiān)督和指導。尤其是他們普遍缺乏實驗動物方面的相關(guān)知識，對動物的微生物控制和屏障設(shè)施的運行管理知之甚少，在管理上稍有疏忽，都有可能使屏障系統(tǒng)淪落為普通級的實驗場所[13]。

3.1 加強人員培訓管理

(1) 參照國際實驗動物評估認證委員會(AAALAC)認證要求，根據(jù)國家《實驗動物管理條例》、《實驗動物質(zhì)量管理辦法》等法規(guī)，學習和借鑒其他高校的經(jīng)驗，結(jié)合自身實際情況，制定了屏障系統(tǒng)內(nèi)各種管理規(guī)定和SOP，以及上崗證培訓制度和內(nèi)容。使得所有工作和實驗人員都能夠有章可循, 規(guī)范執(zhí)行，并在管理實踐過程中不斷地完善。

(2) 所有工作人員包括管理和技術(shù)人員、設(shè)備維護人員、飼養(yǎng)人員等，均須參加上崗證培訓。所有人員在上崗前還須經(jīng)過嚴格的崗位培訓，明確崗位職責，熟悉和掌握屏障系統(tǒng)正常運行的各種程序和操作方法。并且通過外出培訓、邀請行內(nèi)專家進行指導和交流以及員工內(nèi)部復培訓相結(jié)合的方式，不斷加強和提升各類工作人員的業(yè)務水平和專業(yè)技能。

(3) 所有實驗人員都必須參加由動物中心組織的內(nèi)部培訓，培訓內(nèi)容包括理論學習和現(xiàn)場培訓，經(jīng)考核合格并取得上崗證后才能獲得進入權(quán)限。通過豐富多樣的培訓內(nèi)容(制作各種飼養(yǎng)及實驗操作視頻)以及理論(PPT講解理論知識)和實踐(現(xiàn)場指導、練習操作)相結(jié)合的方式，讓實驗人員盡快了解和掌握人員、物品、動物進出屏障系統(tǒng)的方式、方法，以及在動物飼養(yǎng)和實驗過程中的操作細節(jié)和注意事項等，在提高了培訓效率的同時，為屏障設(shè)施內(nèi)的環(huán)境和動物質(zhì)量安全又增加了人員保障。

3.2 加強人員監(jiān)督管理

維護實驗動物屏障設(shè)施內(nèi)環(huán)境和動物的質(zhì)量安全都離不開對人員的監(jiān)督管理。通過對設(shè)施各區(qū)域安裝高清晰監(jiān)控攝像頭, 可對屏障系統(tǒng)內(nèi)工作人員和實驗人員進行全方位實時監(jiān)控。另外質(zhì)量檢驗人員通過不定期現(xiàn)場檢查工作人員和實驗人員的各項制度和標準操作規(guī)程的執(zhí)行情況, 來實施監(jiān)督的職能。發(fā)現(xiàn)違規(guī)操作及時上報并按照違規(guī)的不同性質(zhì)采用警告、張貼公示、通知課題負責人、暫停門禁并重新復培訓等不同處理方式來保障人員合規(guī)操作。

4 結(jié)語

從高校公共實驗動物屏障系統(tǒng)的管理實踐獲知，長期維持屏障系統(tǒng)的潔凈狀態(tài)并非易事，而徹底消除一些既存病原體更是不太現(xiàn)實的。分等級、分區(qū)域管理尤為重要。實驗動物的微生物監(jiān)控管理，沒有統(tǒng)一的適合所有高校實驗動物機構(gòu)的模式，某一監(jiān)測單元的病原體排除列表也不是一成不變的。各實驗動物機構(gòu)必須根據(jù)自身實際情況，做好微生物監(jiān)測的每一個環(huán)節(jié)，制定出符合自身設(shè)施的動物健康監(jiān)測計劃并在實踐中逐步完善。

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