王路明,左艷萍

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科,西安 710038;2西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系;*通訊作者,E-mail:wlmxayxy@126.com)

口腔癌是全球第六大常見惡性腫瘤,每年新增病例約1.1萬例,其早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高[1]?？谇击[狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔癌最常見的病理類型[2],由于OSCC侵襲性強,對多種化療藥物具有抗藥性,5年生存率低于60%[3]。因此,亟需尋找新的有效治療策略。

補骨脂酚(Bakuchiol,BAK)是一種從補骨脂種子中分離得到的單萜苯酚。研究證實,補骨脂酚具有抑制多種腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用,如乳腺癌[4]、胃癌[5]、皮膚癌[6]、肺腺癌[7]等,但補骨脂酚是否能夠抑制OSCC的增殖和轉(zhuǎn)移及其具體分子機制尚無相關(guān)研究報道。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的組蛋白脫乙?；?。充分證據(jù)顯示,激活SIRT1分子能明顯抑制口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),補骨脂酚可以通過激活SIRT1信號通路緩解缺血再灌注損傷[9]。然而,補骨脂酚是否通過激活SIRT1抑制口腔鱗狀細胞癌尚無報道。本研究旨在觀察補骨脂酚對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響,并探究SIRT1信號通路是否介導(dǎo)補骨脂酚對OSCC的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

補骨脂酚、EX527、DAPI(Sigma公司,美國);抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin抗體(CST公司,美國);抗Ac-FOXO1抗體(Santa Cruz公司,美國);抗SIRT1抗體(Abcam公司,美國);TUNEL試劑盒(Roche公司,瑞士);BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司,美國);CCK-8試劑盒(Dojindo公司,日本)。

1.2 細胞培養(yǎng)

OSCC細胞系購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。OSCC細胞系培養(yǎng)條件為:10% Gibco胎牛血清的DMEM、5% CO2、37 ℃恒溫?zé)o菌孵箱。待細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底面80%時進行消化傳代培養(yǎng)。補骨脂酚和EX527均稀釋至含0.1%DMSO的無血清DMEM中以備使用。

1.3 實驗分組及處理

將OSCC細胞分為4組,正常OSCC細胞(control)組;補骨脂酚處理(BAK)組:補骨脂酚處理OSCC細胞24 h;補骨脂酚+SIRT1抑制劑處理(BAK+EX527)組:EX527(100 μmol/L)預(yù)處理OSCC細胞12 h,繼而補骨脂酚處理24 h;SIRT1抑制劑處理(EX527)組:EX527(100 μmol/L)預(yù)處理OSCC細胞12 h。

1.4 細胞活力測定

參照文獻[10]的方法,用CCK-8試劑盒檢測EX527和不同濃度BAK(1,2,5,10 μmol/L)對OSCC細胞活力的影響。具體步驟:將細胞接種于96孔板中,無菌培養(yǎng)箱(5%CO2、37 ℃)12 h;用常溫的PBS清洗細胞3次,以去除培養(yǎng)液;向培養(yǎng)板內(nèi)加入100 μl DMEM和10 μl CCK-8溶液;繼續(xù)培養(yǎng)2 h;用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.5 細胞凋亡率檢測

采用原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL法)檢測各組細胞的凋亡比例。具體操作為:各組實驗處理結(jié)束,用預(yù)冷的PBS清洗細胞3次,以去除懸浮細胞、雜物和培養(yǎng)液;將細胞置于4%多聚甲醛內(nèi)固定15 min,4 ℃;脫水石蠟包埋;切片厚度5 μmol/L;每張切片加50 μl TUNEL染液,置于37 ℃避光環(huán)境下反應(yīng)60 min;PBS清洗3次,每次5 min;用DAPI在避光情況下染核10 min;PBS清洗3次,每次5 min;激光共聚焦顯微鏡拍照。凋亡率=TUNEL染色陽性細胞核/全部細胞核×100%。

1.6 細胞遷移能力檢測

將OSCC細胞培養(yǎng)于6孔板中,待細胞基本覆蓋6孔板底面后,用同一無菌槍頭進行劃痕;用無菌的PBS清洗細胞3次,去除劃痕處細胞,繼而用無血清DMEM處理細胞24 h,拍照;用Image J軟件計算劃痕處細胞間距。

1.7 細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、SIRT1、Ac-FOXO1蛋白表達測定

各組細胞藥物處理后提取細胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。在電泳加樣孔內(nèi)加入等量蛋白質(zhì)(40 μg),10%Bis/Tris凝膠分離蛋白,并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用TBST(150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris,0.1% Tween-20,pH 7.5)稀釋的5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h,孵育抗SIRT1(1 ∶1 000稀釋)、Ac-FOXO1(1 ∶500稀釋)、Bcl-2(1 ∶1 000稀釋)、Bax(1 ∶1 000稀釋)、Caspase-3(1 ∶1 000稀釋)和β-actin(1 ∶5 000稀釋)抗體,4 ℃過夜;用TBST洗滌3次;室溫孵育對應(yīng)的二抗(1 ∶5 000稀釋)1.5 h;用TBST洗滌3次。使用BioRad成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶并使用Image Lab軟件定量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 補骨脂酚濃度依賴性地抑制OSCC細胞活力

與control組細胞相比,補骨脂酚處理(1,2,5,10 μmol/L)可明顯降低OSCC細胞活力,且其作用呈現(xiàn)劑量依賴性。補骨脂酚給藥劑量為5 μmol/L時作用最強(見圖1)。因此選取該劑量進行下一步的作用及機制研究。

與control組相比,*P<0.05圖1 不同劑量補骨脂酚對OSCC細胞活力的影響 (n=6)Figure 1 The effects of different doses of bakuchiol on the cell viability of OSCC cells (n=6)

2.2 補骨脂酚對OSCC細胞SIRT1信號通路的影響

檢測各組細胞內(nèi)SIRT1表達結(jié)果表明,補骨脂酚處理組細胞的SIRT1表達水平較正常OSCC細胞明顯增高(增高約202.03%),而SIRT1下游分子FOXO1的乙?；?Ac-FOXO1)明顯降低(降低約43.12%,P<0.05)。與BAK組相比,BAK+EX527組細胞內(nèi)SIRT1的表達量明顯降低(降低約28.11%),而Ac-FOXO1的表達量明顯增高(增高約167.25%,P<0.05,見圖2)。

2.3 補骨脂酚和EX527對OSCC細胞增殖和凋亡的影響

TUNEL染色法檢測了各組細胞的凋亡情況,各組典型TUNEL染色結(jié)果見圖3。與control組相比,補骨脂酚處理組OSCC細胞的凋亡率明顯增加(P<0.05)。而EX527阻斷SIRT1信號通路后細胞凋亡率與BAK組相比明顯降低(P<0.05,見圖4A)。此外,Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)的表達情況。結(jié)果顯示,與control組相比,BAK可明顯上調(diào)OSCC細胞內(nèi)促凋亡分子Bax和Caspase-3的表達,下調(diào)抗凋亡分子Bcl-2的表達(P<0.05)。而與BAK組相比,EX527可明顯下調(diào)OSCC細胞內(nèi)促凋亡分子Bax和Caspase-3的表達,上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2的表達(P<0.05,見圖4B-E)。CCK法檢測各組細胞的細胞活力,結(jié)果顯示,BAK可明顯抑制OSCC細胞活力(P<0.05)。而與BAK組相比,BAK+EX527組細胞的細胞活力明顯增高(P<0.05,見圖4F)。

與control組相比,*P<0.05;與BAK組相比,#P<0.05圖2 補骨脂酚對OSCC細胞中SIRT1信號通路的影響 (n=6)Figure 2 The effects of bakuchiol on the SIRT1 signaling pathway in OSCC cells (n=6)

2.4 補骨脂酚和EX527對OSCC細胞遷移的影響

通過劃痕實驗檢測了各組細胞的遷移能力。各組細胞劃痕實驗光鏡結(jié)果見圖5。與control組相比,補骨脂酚處理組OSCC細胞的細胞間距明顯增加(P<0.05),即補骨脂酚可以抑制OSCC遷移。而BAK+EX527組細胞間距與BAK組相比明顯降低(P<0.05),提示EX527可削弱補骨脂酚抑制OSCC細胞遷移的作用。單純給予EX527對于細胞遷移能力無明顯影響(見圖6)。

3 討論

補骨脂酚是從補骨脂種子中分離得到的單萜苯酚。以往研究發(fā)現(xiàn),補骨脂酚對于多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有明確的治療作用。Li等[4]證實,補骨脂酚可以通過誘導(dǎo)細胞S期阻滯和細胞凋亡從而發(fā)揮抗乳腺癌的作用。Lin等[5]證實,補骨脂酚可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡和G1期阻滯,從而抑制SGC-7901胃癌細胞的增殖。Kim等[6]研究發(fā)現(xiàn),補骨脂酚可以通過調(diào)節(jié)Hck、Blk和p38 MAPK,進而發(fā)揮抗皮膚癌的作用。但是補骨脂酚是否能夠抵抗口腔鱗狀細胞癌的進展和轉(zhuǎn)歸尚無相關(guān)報道。本研究首次證實,補骨脂酚能夠明顯抑制OSCC細胞的增殖和遷移,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

SIRT1是一種組蛋白脫乙?；?其活性主要取決于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),大量研究證實SIRT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。能量限制可通過提高SIRT1水平抑制結(jié)腸癌細胞增殖和腫瘤形成[11]。Buhrmann等[12]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過靶向激活SIRT1和抑制NF-κB活化抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。紫草素可通過激活FOXO3a/EGR1/SIRT1信號通路,誘發(fā)肺癌細胞凋亡,從而抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展[13]。但也有文獻報道,激活SIRT1可促進腫瘤的形成。二甲雙胍可以通過抑制SIRT1表達來增強化療藥物和氧化應(yīng)激對癌細胞的殺傷能力[14]。在晚期前列腺癌組織中SIRT1的表達量較早期癌組織明顯增高,而過量表達的SIRT1分子對于前列腺癌的進展發(fā)揮了重要作用[15]。17β-雌二醇和雌激素受體特異性配體可通過結(jié)合雌激素受體上調(diào)SIRT1的表達,進而激活EGFR/ERK/c-fos/AP-1信號通路,最終促進乳腺癌細胞的增殖和裸鼠腫瘤細胞移植瘤的形成[16]。過表達SIRT1分子可導(dǎo)致惡性卵巢上皮細胞癌化療藥物抵抗和預(yù)后不良[17]。通過總結(jié)國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn),SIRT1發(fā)揮抗腫瘤作用抑或促腫瘤作用主要決定于腫瘤類型[18]。在OSCC中,充分證據(jù)顯示,過表達SIRT1可在體外抑制OSCC細胞遷移,并在體內(nèi)限制其轉(zhuǎn)移。此外,在轉(zhuǎn)移性O(shè)SCC細胞中,上調(diào)SIRT1可顯著抑制其遷移和侵襲能力,同時增加E-鈣黏蛋白的表達,降低間充質(zhì)標(biāo)記物的表達[8]。本研究證實,補骨脂酚處理可以明顯增加腫瘤細胞內(nèi)SIRT1的表達量,且SIRT1下游分子FOXO1的乙?；矫黠@降低,提示補骨脂酚也可明顯增強SIRT1的去乙酰化酶活性。補骨脂酚提高SIRT1分子表達及活性的同時,也增加了OSCC細胞的凋亡率、上調(diào)了OSCC細胞中促凋亡分子Bax和Caspase-3的表達量、下調(diào)了抗凋亡分子Bcl-2的表達量、以及抑制了腫瘤細胞的遷移。而抑制SIRT1信號通路后,補骨脂酚上述作用明顯削弱。

圖3 各組OSCC細胞凋亡的TUNEL染色Figure 3 Apoptosis of OSCC cells in each group by TUNEL

與control組相比,*P<0.05;與BAK組相比,#P<0.05圖4 補骨脂酚和EX527對OSCC細胞增殖和凋亡的影響 (n=6)Figure 4 The effects of bakuchiol and EX527 on the apoptosis and proliferation of OSCC cells (n=6)

圖5 各組OSCC細胞劃痕實驗結(jié)果(光鏡×200)Figure 5 Results of the OSCC cell wound healing in each group (×200)

與control組相比,*P<0.05;與BAK組相比,#P<0.05圖6 補骨脂酚和EX527對OSCC細胞遷移的影響 (n=6)Figure 6 Effects of bakuchiol and EX527 on the migration of OSCC cells (n=6)

綜上所述,本研究首次證實補骨脂酚是抵抗OSCC細胞增殖和遷移的新的有效治療藥物,且其抗腫瘤作用的發(fā)揮主要由SIRT1信號通路介導(dǎo)。該研究為臨床上應(yīng)用補骨脂酚治療OSCC提供了新的理論依據(jù)。

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