郭 芳,申鳳俊,吳龍龍,高 陽

(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院消化內(nèi)科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:sfj919016603@126.com)

肝纖維化是由各種病因引起的慢性反復肝損傷后的反應，其表現(xiàn)為肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)的彌漫性過度沉積。研究表明，肝內(nèi)存在完整的局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-AngⅡ-血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)軸是RAS系統(tǒng)的經(jīng)典軸，而AngⅡ是經(jīng)典軸中的主要效應因子，它能有效刺激肝星狀細胞(HSC)使之增殖與活化，并釋放出炎癥因子和促纖維化因子，進一步促進了肝纖維化[1,2]。局部AngⅡ?qū)Ω螕p傷的研究發(fā)現(xiàn), AngⅡ通過激活活性氧簇(ROS)增加肝損傷，而加用ACE抑制劑后可以減低肝損傷的程度[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，由NOX產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)介導的氧化應激反應與肝纖維化的發(fā)生關系密切，其中，NOX家族之一的NOX4被發(fā)現(xiàn)在活化的肝星狀細胞(HSC)中表達更為豐富，并且可通過介導多條細胞信號通路參與了肝纖維化的形成[4]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ的促纖維化效應需要NADPH氧化酶及其產(chǎn)生的ROS來實現(xiàn)[5]。因此，本實驗通過CCl4建立肝纖維化大鼠模型，觀察貝那普利對肝纖維化大鼠中NOX4及AngⅡ表達的影響，進一步探討其抗纖維化機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

22只6周齡雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量180-210 g，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證：scxk(晉)2012-0001。AngⅡELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，隨機引物、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自上海生工生物科技有限公司；貝那普利由北京諾華制藥有限公司提供。

1.2 模型建立及標本制備

將22只大鼠隨機分為正常對照組6只,模型組8只,貝那普利治療組8只。除對照組外,余兩組均給予皮下注射40%CCl4油劑,2次/周,首次5 ml/kg,以后每次2 ml/kg,對照組給予相同劑量的油劑皮下注射。預防治療組從實驗第1天開始給予貝那普利(10 mg/kg)灌胃,余兩組給予相同劑量生理鹽水灌胃,直至實驗結(jié)束。三組大鼠均給予正常飲食。在第8周時,正常對照組、模型組和預防治療組分別殺死大鼠6只,留取同一部位肝組織備用。

1.3 組織病理檢查

對肝組織行常規(guī)HE染色及Masson三色染色,觀察各組肝組織病理改變及纖維化程度。

1.4 AngⅡ測定

采用酶聯(lián)免疫試劑盒雙抗體夾心ABC-ELISA法測定肝勻漿AngⅡ濃度。

1.5 RT-PCR檢測NOX4mRNA表達

采用Trizol試劑一步法抽提肝組織中總RNA,微量分光光度計檢測RNA樣品純度。然后按照Fermentas K1622反應體系進行逆轉(zhuǎn)錄以及RT-PCR反應體系及條件按試劑盒說明書進行。

以β-actin 作為內(nèi)參照基因,上游:5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′,下游:5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3′,長度為141 bp;NOX4上游:5′-CGGGTGGCTTGTTGAAGTAT-3′,下游:5′-AAAACCCTCCAGGCAAAGAT-3′,長度為147 bp。

結(jié)果判定:ΔCt=Ct-Ctβ-actin。用各實驗組樣本的ΔCt減去正常對照組樣本的ΔCt,得到ΔΔCt,以 2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

以上數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差,應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料組間比較采用單因素方差分析;相關性分析采用Spearman相關分析法,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病理表現(xiàn)

觀察肝組織HE染色與Masson三色染色切片,正常對照組肝小葉的結(jié)構(gòu)正常,肝細胞索排列規(guī)則。模型組可見部分肝小葉結(jié)構(gòu)的消失,纖維間隔包繞形成了假小葉。治療組大鼠肝組織的纖維化程度與模型組相比,有所減輕(見圖1)。

2.2 貝那普利對肝纖維化大鼠肝勻漿AngⅡ的影響

模型組、預防治療組與對照組肝勻漿AngⅡ表達量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；并且預防治療組與模型組中的肝勻漿AngⅡ表達量差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 貝那普利對肝纖維化大鼠肝組織NOX4 mRNA表達的影響

模型組及預防治療組與對照組比較,NOX4表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);并且模型組和預防治療組NOX4表達差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。

2.4 相關性分析

將肝勻漿AngⅡ與肝組織NOX4 mRNA的表達進行Spearman相關性分析，顯示肝勻漿AngⅡ濃度與肝組織NOX4 mRNA表達變化存在顯著正相關(相關系數(shù)r=0.472，P<0.05)。

3 討論

肝纖維化是由各種致病因子致使肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積。如未能及時的治療,最終進展為肝硬化甚至肝癌危害人類的健康。既往有研究表明,肝纖維化是肝硬化的早期階段并且是必經(jīng)階段,亦是唯一可被逆轉(zhuǎn)的階段[6]。因此我們通過本實驗研究貝那普利的抗肝纖維化作用及其相關機制具有重要的臨床意義。

A.對照組HE; B.模型組HE;C.治療組HE;D.對照組Masson;E.模型組Masson;F.治療組Masson圖1 對照組、模型組及治療組肝組織病理表現(xiàn)Figure 1 Histopathological changes of liver in control group, model group and treatment group

分組 nNOX4AngⅡ(ng/ml)正常對照組62．03±0．3123．330±1．606模型組631．78±3．96?48．625±1．357?貝那普利治療組615．93±5．01?#45．518±3．072?#

與對照組相比,*P<0.05,與模型組相比,#P<0.05

研究表明，肝臟中存在獨立的RAS系統(tǒng)，其經(jīng)典軸為ACE-AngⅡ-AT1軸，并且發(fā)現(xiàn)AngⅡ是經(jīng)典軸中的主要多肽，其水平與肝纖維化的程度呈正相關[7]。在肝組織及肝細胞受到刺激或者損傷時，RAS系統(tǒng)就會被激活，其主要的效應物質(zhì)AngⅡ通過與AT1結(jié)合后刺激各種細胞因子、炎癥因子的釋放以及HSC活化，促進了EMC的合成,打破了以往EMC合成與降解的平衡，從而促進了肝纖維化的形成。而作為一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，貝那普利已被證實具有良好的抗纖維化作用[8,9]，其抗纖維化作用可能是通過抑制AngⅡ的產(chǎn)生進而減弱ACE-AngⅡ-AT1軸的激活。本實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組肝勻漿AngⅡ升高(P<0.05)；而給予貝那普利預防治療后，肝勻漿AngⅡ表達量較模型組有所下降(P<0.05)，并且肝組纖維化程度也明顯減輕。這與先前的研究結(jié)果是一致的。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ不僅通過ATIR受體導致促纖維化因子的產(chǎn)生，它還可能通過作用于NOX產(chǎn)生ROS誘導氧化應激反應而促進肝纖維化的進展[5]。

NOX是一種多亞基的跨膜酶復合體, 目前已發(fā)現(xiàn)包括肝臟、腎臟、心臟等組織中存在表達。NOX家族由NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5及兩個雙重氧化酶Duox1和Doux2組成[10]。近年來的研究證實，NOX通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)介導的氧化應激反應與肝纖維關系密切。值得一提的是，肝細胞內(nèi)NOX4的表達遠遠高于其他NOX亞型，并且是產(chǎn)生ROS的主要的亞型[11,12]。Bettaieb等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝炎(NASH)病人及飲食誘導的脂肪性肝炎小鼠中NOX4表達增多,給予其NOX4抑制劑后明顯減輕了肝炎、肝纖維化的程度。此外，Jiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)NOX4是一個重要的促纖維化因子，可激活TGF-β/Smad通路，使Smad3磷酸化介導了HSC的活化，并且NOX4在死亡配體誘導的肝細胞凋亡中也起著重要的作用。并且我們前期研究也證實：隨著肝纖維化的形成，大鼠肝組織中NOX4的表達升高[9]。既往很多研究已發(fā)現(xiàn)貝那普利具有良好的抗纖維化作用，那么貝那普利能否通過抑制AngⅡ并進一步抑制NOX4介導的氧化應激反應而減輕肝纖維化程度，這方面研究報道甚少。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組肝組織中NOX4表達升高(P<0.05)；在給予貝那普利進行干預后，肝組織中NOX4表達下降(P<0.05)。進一步進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，AngⅡ與肝組織中NOX4 mRNA表達變化存在正相關性(r=0.472，P<0.05)。以上結(jié)論不僅證實了貝那普利的抗肝纖維化作用，并且表明其抗纖維化作用可能是通過抑制AngⅡ的表達進一步抑制NOX4介導的氧化應激反應來實現(xiàn)的。因此，進一步研究NOX4介導的氧化應激與肝纖維化的關系有望為肝纖維化的治療策略提供一些新思路。

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