高建鵬，張子榮，張奇波，楊 武，齊亞銀*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 五家渠 931300；3.新疆克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，新疆 克拉瑪依 834000)

奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎，主要是由于奶牛乳腺受微生物、物理、化學和環(huán)境等因素刺激從而產(chǎn)生的一類炎癥反應。奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)常見的一種臨床疾病，引起乳房炎的微生物種類有很多,如細菌、病毒、真菌、支原體等,人們己從乳房炎的乳汁中分離到了130多種微生物,較常見的有20多種,以細菌感染比較多見,其中大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌具有國際廣泛性,是引發(fā)乳房炎的主要致病菌,也有少數(shù)病原菌如大腸桿菌、化膿棒狀桿菌、蠟樣芽抱桿菌、綠膿桿菌等也可引起地方性流行。此外有人發(fā)現(xiàn)，乳粉抱霉、馬紅球菌、糞產(chǎn)堿桿菌、克柔氏念珠菌、粘質(zhì)沙雷氏菌等一些國內(nèi)外未見報道的病原微生物也可引起奶牛乳房炎。

大腸桿菌一直被認為是環(huán)境致病菌,但是近年來有人提出將其列為傳染性致病菌。大腸桿菌具有很多毒力因子,其中LSP是大腸桿菌主要的致病毒力因子,能夠引起動物機體急性炎癥過程。奶牛發(fā)生大腸桿菌性乳房炎時,多為急性炎癥過程,機體過度的炎癥反應造成了乳腺上皮細胞的損傷、脫落,從而降低了產(chǎn)奶量,甚至會引起奶牛乳區(qū)的萎縮、壞死而喪失生產(chǎn)性能并可能誘發(fā)敗血癥,導致急性死亡。給奶牛養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟損失。

2016年9月，新疆北疆地區(qū)某規(guī)?；龅牟糠帜膛０l(fā)生了以乳房炎為主要特征的病例，患牛體溫升高、精神沉郁、食欲不佳。乳房觸摸有硬塊，乳房或乳頭腫脹，乳汁中有絮片、凝塊，部分乳汁為血乳，乳汁顏色發(fā)黃或發(fā)紅，產(chǎn)奶量減少或無奶。為查明導致該病發(fā)生的主要致病菌，提供一套治療方案，本研究對患乳房炎的奶牛進行了病原菌的分離和鑒定，為篩選敏感藥物及科學防治奶牛乳房炎提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 新疆石河子某發(fā)病牛場的臨床性乳房炎奶樣兩份。

1.1.2 培養(yǎng)基與生化試劑 LB肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基等各種生化試驗用培養(yǎng)基參照文獻[1]配置，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；革蘭氏染液購自于貝索生物科技有限公司；細菌微量發(fā)酵管購自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.1.3 主要器械 超凈工作臺(0066)，上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品；全自動恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2102C)，(上海智城分析儀器制造有限公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GH-600BC)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；4℃冰箱(BCD-209 S/D)，海信容聲冰箱有限公司產(chǎn)品；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(HVE-50/HV-25，HIRAYAMA)及實驗室常用大小試管及平皿。

1.1.4 藥敏試驗 氨芐西林(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩諾沙星(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、青霉素(10U/片)、鏈霉素(10 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、頭孢唑啉(30 μg/片)、呋喃妥因(300 μg/片)等藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 染色鏡檢 將奶樣涂片進行革蘭氏染色，鏡檢觀察細菌染色特性及形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 將乳樣搖勻后，取100 ul接種于LB肉湯中，置37℃搖床內(nèi)振蕩擴增培養(yǎng)18～24 h后染色鏡檢，將擴增后肉湯中的細菌分別在普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h后挑取典型的紅色單個菌落染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)及染色特性，后再次接種到伊紅美藍培養(yǎng)基中培養(yǎng)，18～24 h后觀察細菌形態(tài)，染色鏡檢對其鑒定，最后將已純化的細菌進行保存。

1.2.3 生化鑒定 分離菌的生化鑒定，參照文獻[2-3]的方法進行。將已分離純化的菌株進行M.R、V-P、三糖鐵、檸檬酸鈉、吲哚、甘露醇、棉子糖、山梨醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖等生化試驗，觀察其生化反應特性。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，參照趙占峰等[4]根據(jù)NCCLS(美國臨床實驗室標準化委員會)標準判定試驗結果。將純化菌株在37 ℃營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18～24 h，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度約為2×106個/mL，用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板。每個平板貼6張藥敏紙片為宜，兩紙片相距25 mm，紙片與平板邊緣10 mm～15 mm，并輕按紙片中心，使其附著嚴密，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。測量抑菌圈直徑，判定分離菌株對藥敏紙片的敏感性。

2 結果及分析

2.1 形態(tài)特征及培養(yǎng)特性

在37℃恒溫培養(yǎng)箱中經(jīng)24 h培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，分離菌菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、表面濕潤光滑、不透明、圓形的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上呈鮮桃紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，符合大腸桿菌特性(圖1)；挑選符合大腸桿菌生長特性的菌落，革蘭氏染色鏡檢，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)兩端鈍圓的淡紅色短狀桿菌(圖2)；在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成圓形、隆起、光滑且具有金屬光澤的菌落(圖3)。結果發(fā)現(xiàn)，從兩份奶樣中兩株疑似大腸桿菌。

圖1 分離菌麥康凱培養(yǎng)基上生長狀況

圖2 顯微鏡鏡檢結果

圖3 分離菌伊紅美藍培

2.2 生化鑒定結果

生化結果顯示，兩株分離菌的M.R反應都變?yōu)榧t色為陽性；V-P反應不變色為陰性；吲哚反應變?yōu)榧t色為陽性；檸檬酸鈉反應不變色為陰性；三糖鐵斜面能產(chǎn)氣、產(chǎn)酸，不生成H2S；能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、山梨醇和甘露醇,不同的是一株可以分解蔗糖，另一株不能分解蔗糖。該試驗結果符合大腸桿菌的生化鑒定，生化特性鑒定結果見表1和表2。

表1 分離株1的生化反應結果

注：“+”為產(chǎn)酸/陽性；“-”為不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣/陰性。

表2 分離株2的生化反應結果

注：“+”為產(chǎn)酸/陽性；“-”為不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣/陰性。

2.3 藥敏試驗

對分離培養(yǎng)獲得的純化菌株進行藥敏試驗,結果顯示，分離菌株對氨芐西林和頭孢唑啉高度敏感；對氧氟沙星、恩諾沙星、克林霉素、慶大霉素、呋喃妥因中度敏感；對青霉素、阿莫西林、鏈霉素、四環(huán)素耐受。試驗結果見表3。

3 討論

本試驗從采集的乳樣中分離出兩株細菌，通過分離培養(yǎng)結果、形態(tài)學觀察、生化特性分析對其進行鑒定，結果表明，分離菌株為大腸桿菌。

隨著抗生素對細菌的選擇壓力越來越大，許多大腸桿菌對常用抗菌藥物的敏感性日益降低，耐藥菌株越來越多，各地所分離的大腸桿菌對抗生素的差異很大，目前很難確定一個能普遍使用的抗菌藥物敏感譜[5]。方光遠[6]等(2010)從南京某規(guī)?；雠R床性乳房炎患牛分離出的大腸桿菌對頭孢類抗生素高度敏感與本實驗分離的大腸桿菌耐藥性基本相同，而對慶大霉素、鏈霉素低度敏感，與本實驗分離的大腸桿菌的耐藥性有一定差異；朱少奇等[7](2011)從黑龍江黑河市周邊地區(qū)臨床型乳房炎分離出的大腸桿菌對青霉素與鏈霉素耐藥，此結果與本實驗大腸桿菌耐藥性高度一致。說明大腸桿菌早已對此類抗生素產(chǎn)生了嚴重的耐藥性；劉通等[8](2016)對黑龍江某規(guī)?；鲋氯榉垦状竽c桿菌進行藥敏試驗，對四環(huán)素高度敏感的結果與本實驗結果有很大差異。對于新疆，不同地域分離到的大腸桿菌耐藥性也會有所不同。覃杰等[9](2014)對新疆鐵門關地區(qū)(南疆)奶牛乳房炎大腸桿菌進行藥敏試驗，結果顯示大腸桿菌對克林霉素高度敏感，對氨芐西林耐藥，這與本試驗大腸桿菌耐藥性有所不同；賈林軍等[10](2014)對新疆昌吉地區(qū)(北疆)致奶牛乳房炎大腸桿菌進行藥敏試驗，顯示大腸桿菌對青霉素、慶大霉素、氨節(jié)西林中度敏感，此結果與本實驗藥敏結果有差異。

表3 分離株藥敏試驗結果

從藥敏試驗結果看，分離菌株對常規(guī)抗生素如阿莫西林、青霉素、鏈霉素等均產(chǎn)生較強的耐藥性，其可能是由于該奶牛場長期使用上述常規(guī)抗生素或此菌株由牛場外傳入引起奶牛發(fā)病，在傳入之前已經(jīng)對上述常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性。因此在治療奶牛乳房炎大腸桿菌感染時，最好選用經(jīng)抗生素敏感試驗確證為高效的藥物用于治療才能收到良好的效果[11]。建議牛場在防治大腸桿菌病時，對菌株進行藥敏試驗，根據(jù)試驗結果用2-3種敏感藥物按療程和足夠的劑量交替使用。

奶牛的飼養(yǎng)管理、牛舍及周圍環(huán)境、工作人員的操作以及擠奶器械消毒等環(huán)節(jié)的問題都將會導致奶牛乳房炎的發(fā)生。我們在采樣中發(fā)現(xiàn)，該牛場選址離公路較近，在泌乳牛舍中刺鼻氣味重，捕蠅籠與糞污清理不及時，圈舍外糞便堆積地點和圈舍距離過近，這些因素都極有可能導致牛場奶牛乳房炎的發(fā)生。因此應加強奶牛的飼養(yǎng)管理，改善牛舍及周圍環(huán)境衛(wèi)生，保持牛舍通風干燥且定期清洗牛舍和對牛舍進行滅菌消毒。此外要定期對奶牛進行檢查，對久治不愈的臨床型乳房炎患牛應淘汰[12]。同時應規(guī)范擠奶程序，做好擠奶用具的消毒工作，防止擠奶過程中的微生物感染。

參考文獻:

[1] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001．

[2] 王建永,張磊,趙月蘭,等.腹瀉犢牛病原分離鑒定及藥敏實驗[J].動物醫(yī)學進展，2010，31(5):118-121

[3] Metter K B,Lisbeth N P,Jens K M.Eight-plex PCR and liquidarray ditection of bacterial and viral pathogens in cerebrospinal fluid from patients with suspectedmemingitis[J].JClinMicrobiol,2009,47(4):908-913

[4] 趙戰(zhàn)峰,宋軍科,于三科.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定[J].動物醫(yī)學進展,2010,31(4):113-115.

[5] 王志遠，宋冶萍.青島市奶牛乳房炎的病原分離與鑒定[J].畜牧與獸醫(yī),2002,34(7):31.

[6] 方光遠,秦和春,顧亞鳳,晏文梅,張志成,杜改梅. 奶牛臨床型乳房炎大腸桿菌的分離與鑒定[J]. 中國奶牛,2010,28(09):34-36.

[7] 朱少奇,喬潔. 黑龍江省黑河市周邊地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 中國乳業(yè),2011,10(09):38-40.

[8] 劉通,劉宇,趙靜虎,王華欣,周金玲,岳山,何泊寧,劉珊珊,張世勛,王天,劉增祿,朱戰(zhàn)波. 黑龍江某規(guī)?；瘓瞿膛＜毙匀榉垦撞≡蛛x鑒定與藥敏實驗[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學學報,2016,28(06):65-68.

[9] 覃杰,龍杰,張偉,張浩鈿. 新疆鐵門關地區(qū)奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及主要病原菌藥敏試驗[J]. 中國奶牛,2014,32(21):24-26.

[10] 賈林軍,蘇艷. 新疆昌吉地區(qū)大腸桿菌致奶牛隱性乳房炎的調(diào)查與分析[J]. 湖北畜牧獸醫(yī),2014,35(01):5-7.

[11] 陳坤永，翁良樹，吳慕貞,等.深圳地區(qū)奶牛臨床型乳房炎病原菌分離鑒定與藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)科技,1999,29(9):36-38.

[12] 伍清林，金蘭梅,等. 乳牛舍內(nèi)環(huán)境空氣中細菌數(shù)量與乳房炎的關系研究[J].中國奶牛, 2010, 28(01):39-41.