王曉敏，白冰，李娟，張凱，謝茵，荀波娜，畢小平，*

（1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西太原030001；3.山西琪爾康翅果生物制品有限公司，山西太原030001；4.山西大醫(yī)院，山西太原030001）

翅果油是以翅果經(jīng)超臨界流方法萃取的一種無溶劑殘留的綠色、營養(yǎng)豐富的植物油。含有棕擱酸、油酸、亞油酸、亞麻酸4種主要的脂肪酸，且油酸與亞油酸含量比例適合人體的需要模式，具有“天然母乳”美稱。此外，它還含有多種人體必需但是須從外界攝取的氨基酸，尤其是維生素E的量居各種油料之冠。研究表明，翅果油具有預(yù)防動脈粥樣硬化、抗氧化、降血脂、肝細(xì)胞再生，促進(jìn)大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，改善免疫功能、改善睡眠、延緩機(jī)體衰老等重要保健作用[1-4]。但到目前為止，對其抗疲勞機(jī)制的研究卻鮮有報道。隨著醫(yī)藥工業(yè)的快速發(fā)展，應(yīng)用于醫(yī)藥研究的新制劑技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[5]。亞微乳（submicro emulsion）即以油相、水相和乳化劑制成的粒徑為0.1 μm～1 μm的新型乳劑，可供靜脈注射，具有安全性好，給藥方便，無刺激性，利用度高等優(yōu)點(diǎn)，臨床上廣泛用作胃腸外給藥載體[6]：而且，亞微乳還可作為新型靶向制劑，選擇性作用于病變部位，治療效果顯著[7]。結(jié)合亞微乳劑型和翅果油的優(yōu)勢，通過將亞微乳作為藥物載體，旨在制備出一種口感好，生物利用度高，吸收好，安全穩(wěn)定，刺激性小的新型口服乳劑。

疲勞是反應(yīng)在生理和心理上的一種復(fù)雜的機(jī)體狀態(tài)，也是人體適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境刺激的自身防御機(jī)制，即機(jī)體不能維持預(yù)定運(yùn)動強(qiáng)度致使體力和運(yùn)動耐力下降的一種生理反應(yīng)[8]。中醫(yī)認(rèn)為，疲勞人群常常呈現(xiàn)為亞健康狀態(tài)，這種狀態(tài)下人心理焦慮不安，各項機(jī)能明顯減退，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)器質(zhì)性病變[9-10]。據(jù)報道，我國每年有60%～70%的人群處于疲勞的亞健康狀態(tài)，市場對緩解運(yùn)動性疲勞產(chǎn)品的需求很大。因此，對緩解體力疲勞的功能性食品的研究與開發(fā)，以及從天然植物資源中提取抗疲勞活性成分意義重大。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

翅果油：山西琪爾康翅果生物制品有限公司；聚甘油脂肪酸酯、硬脂酰乳酸鈉、檸檬酸脂肪酸脂：河南奧尼斯特食品有限公司；單硬酯酸甘油酯、蔗糖脂肪酸甘油酯：鄭州市食代添驕化工產(chǎn)品有限公司；卵磷脂：鄭州四維生物科技有限公司；食用甘油：鄭州特正商貿(mào)有限公司；山梨酸鉀：浙江保圣科技有限公司；全血乳酸（blood lactic acid，BLA）檢測試劑盒、血清尿素氮（serum urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒、肝糖原（hepatic glycogen，LG）檢測試劑盒：上海優(yōu)選生物科技有限公司；實驗動物（ICR小鼠）：山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（晉）2015-0001。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器79-1：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；Z326K高速冷凍離心機(jī)：德國科學(xué)儀器有限公司；MP3002電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；馬爾文粒徑儀（Nano-Zs90）、Mulitiskam 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技有限公司；Vortex-5渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機(jī)：賽默飛世爾科技有限公司；超低溫冰箱：賽默飛世爾科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海艾牧生物科技有限公司；電動玻璃勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 翅果油亞微乳的制備

2.1.1 工藝流程

2.1.1.1 O相的制備

按照處方量將卵磷脂，單硬脂酸甘油酯溶于翅果油→不斷攪拌，70℃水浴加熱→為O相。

2.1.1.2 W相的制備

按處方量將聚甘油脂肪酸酯、食品級甘油溶于蒸餾水中→不斷攪拌，70℃水浴加熱→為W相。

2.1.1.3 乳劑的制備

將W相緩緩加入至O相中，保持兩相溫度相同→70℃浴加熱，持續(xù)攪拌→加水至全量，形成果油亞微乳初乳→高壓均質(zhì)機(jī)對初乳進(jìn)行高壓均質(zhì)→制備成粒度均勻的翅果油亞微乳。

2.1.2 評價指標(biāo)

外觀、離心試驗、離心穩(wěn)定性系數(shù)Ke值、粒徑及ζ電位等作為主要評價指標(biāo)。對制備出的翅果油亞微乳進(jìn)行質(zhì)量評價。

2.1.3 翅果油亞微乳的單因素試驗

考察乳化劑的類型及用量符合GB2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的乳化劑，助乳化劑的類型及用量：對乳化劑和助乳化劑的組成比進(jìn)行篩選（乳化劑/助乳化劑質(zhì)量比為 4∶1、3∶1、2 ∶1及1∶1）；防腐劑類型的篩選（山梨酸鉀、苯甲酸鈉及尼泊金酯類）；乳化溫度（50、60、70、80℃）；乳化方法（干膠法、濕膠法、混合法）等各個因素對翅果油亞微乳的質(zhì)量的影響，確定翅果油亞微乳的處方組成。

2.1.4 翅果油亞微乳的工藝優(yōu)化

以“2.1.2”項下的指標(biāo)為依據(jù)，采用正交方案設(shè)計優(yōu)化處方及工藝，選擇對配制乳劑有較大影響的4因素為指標(biāo)，即乳化溫度、攪拌時間、乳化方法、轉(zhuǎn)速，每個因素又選擇3個水平，采用L9（34）正交試驗設(shè)計。極差分析，確定其最優(yōu)處方。對初乳高壓均質(zhì)條件即均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)進(jìn)行考察。

2.2 動物分組與灌胃

選擇小鼠100只，雌性，體重在18 g～22 g之間，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由攝食與飲水，12 h光照/黑暗交替飼養(yǎng)。對小鼠進(jìn)行游泳篩選，剔除不會游泳的小鼠后，將100只小鼠隨機(jī)分為陰性對照組與翅果油低、中、高劑量組及亞微乳組，分別灌胃給予蒸餾水，1.25、2.5、5 mL/kg體重的翅果油及23.7 mL/kg體重（相當(dāng)于低劑量組載油量）的翅果油亞微乳。

2.3 抗疲勞試驗

2.3.1 小鼠負(fù)重游泳試驗和力竭游泳時間測定

按照2.2項下，將100只小鼠隨機(jī)分為陰性對照組與翅果油低、中、高劑量組及亞微乳組，陰性對照組灌胃給予蒸餾水，試驗組分別灌胃給予翅果油低（1.25 mL/kg）、中（2.5 mL/kg）、高（5 mL/kg）劑量及亞微乳組（23.7 mL/kg），每組10只。對各試驗組小鼠連續(xù)灌胃30 d，且隔天游泳訓(xùn)練1次，每次20 min～30 min，末次灌胃30 min后，小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，放入大小約（50 cm×50 cm×40 cm）的游泳箱中游泳，水深不少于30 cm，水溫（25±0.5）℃，進(jìn)行負(fù)重游泳試驗，觀察并記錄各試驗組小鼠從游泳開始至頭部沉入水中10 s仍不能返回水面的時間，作為小鼠的力竭游泳時間。并與陰性對照組進(jìn)行比較，計算其負(fù)重游泳時間的延長率[11]。

2.3.2 全血乳酸（BLA）的含量測定及清除率計算

末次灌胃30 min后，將小鼠置于游泳箱（T=30℃）中不負(fù)重游泳60 min后將小鼠取出，并迅速擦干。分為2組，其中一組立即摘眼球取血后脫臼處死。將血液置于抗凝管中，離心取血清待測。根據(jù)試劑盒要求測定BLA的含量；另一組小鼠泳后置于安靜環(huán)境中休息60 min后，采用相同的方法測定BLA含量，并計算其清除速率[12]。

計算公式為：

式中：v代表清除速率，mmol/（L·min）；c0代表泳后0 min被測指標(biāo)的濃度，mmol/L；ct代表泳后t時刻被測指標(biāo)的濃度，mmol/L；t代表清除時間，min。

2.3.3 血清尿素氮（BUN）的含量測定

小鼠末次灌胃30 min后，將小鼠置于游泳箱（T=30℃）中不負(fù)重游泳60 min后將小鼠取出，并迅速擦干。分為2組，其中一組立即摘眼球取血后脫臼處死。將血液置于抗凝管中，離心取血清待測，另一組小鼠泳后置于安靜環(huán)境中休息60 min后，根據(jù)試劑盒操作說明測定各試驗組小鼠BUN的含量，并計算其清除速率v1。

2.3.4 肝糖原（LG）的測定

末次灌胃30 min后，使小鼠在溫度30℃的水箱中不負(fù)重游泳60 min，將小鼠取出擦干，分為2組，一組立即脫臼處死取材。在冰板上迅速取小鼠的肝臟組織，用冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，放入液氮中速凍后，取出凍存于-80℃的冰箱中，待測[13]。另一組小鼠泳后置于安靜環(huán)境中休息60 min后同法取樣。按照試劑盒要求的方法測定LG的含量，計算小鼠泳后不同時刻的肝糖原相對儲備量。

2.3.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析進(jìn)行均值比較。若方差齊，各組間兩兩比較用LSD法：方差不齊，各組間兩兩比較采用Tamhane法。計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05表示結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 翅果油亞微乳的處方篩選結(jié)果

3.1.1 單因素試驗結(jié)果

翅果油亞微乳的油相為翅果油、表面活性劑為單硬脂酸甘油酯，聚甘油脂肪酸酯，卵磷脂的復(fù)配乳化劑、助表面活性劑為食品級甘油。處方組成為Km=1∶1，表面活性劑/助表面活性劑∶翅果油質(zhì)量比為4∶5，即混合乳化劑為4%、翅果油5%、甘油為4%，蒸餾水為76%，山梨酸鉀為1%，蔗糖為10%。

3.1.2 正交試驗結(jié)果

翅果油亞微乳正交直觀分析結(jié)果見表1。

表1 翅果油亞微乳正交直觀分析結(jié)果Table 1 Results of the elaeagnus mollis oil submicron-emulsion orthogonal test

Ke值表示離心穩(wěn)定系數(shù)，Ke值越小，表明乳劑越穩(wěn)定。由表1的極差分析可知，各因素對該處方翅果油亞微乳制備的影響大小順序為：B＞C＞D＞A：即影響因素依次為：攪拌速度＞溫度＞乳化方法＞攪拌時間：各因素以K值最優(yōu)的制備工藝為A3B2C3D1，按照最優(yōu)處方制備的翅果油亞微乳的Ke值為0.156，實驗方案5的Ke值為0.12，試驗結(jié)果表明，按照試驗5制備的亞微乳更加穩(wěn)定。因此，綜合考慮后制備工藝確定為A3B2C3D1。即以干膠法，在70℃水浴、1 500 r/min轉(zhuǎn)速條件下，攪拌40 min制備得到初乳。

3.1.3 高壓乳勻的工藝優(yōu)化結(jié)果

考察高壓均質(zhì)機(jī)的均質(zhì)次數(shù)和壓力對翅果油亞微乳的影響結(jié)果見圖1。

由圖1A顯示，Ke值隨均質(zhì)次數(shù)的增加，呈先抑后揚(yáng)之勢，當(dāng)均質(zhì)6次時，Ke值最小，圖1B顯示，粒徑隨均質(zhì)次數(shù)的增加而降低。綜合考慮均質(zhì)次數(shù)對Ke值、粒徑的影響，均質(zhì)6次為宜：圖1C顯示，Ke值隨均質(zhì)壓力的增加而降低，圖1D亦顯示，粒徑隨均質(zhì)壓力的增加而降低，當(dāng)壓力達(dá)600×105Pa時，粒徑降低減緩，故均質(zhì)壓力600×105Pa為宜。

圖1 考察高壓均質(zhì)機(jī)的均質(zhì)次數(shù)和壓力對翅果油亞微乳的影響Fig.1 The homogenization times and pressure of high pressure homogenizer were investigated for the effect of elaeagnus mollis oil submicron-emulsion

3.2 翅果油及其亞微乳對小鼠體重增重的影響

灌胃30天后，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對各試驗組小鼠的體重進(jìn)行分析。結(jié)果見表2。

由表2可知，試驗前小鼠的初始體重，各試驗組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明動物的初始體重在各組間較為均衡，以后每周及試驗?zāi)┢诟鹘M間小鼠體重差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明翅果油各劑量組、翅果油亞微乳組、蒸餾水灌胃對小鼠體重增長無影響。

表2 翅果油及其亞微乳對小鼠增重的影響（n=20）Table 2 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on the body weight in mice（n=20）

3.3 翅果油及其亞微乳對小鼠力竭游泳時間的影響

負(fù)重游泳時間可以反映小鼠運(yùn)動耐力，能夠描述運(yùn)動疲勞的程度。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，對不同組別小鼠的游泳力竭時間及平均延長率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果見表3。

表3 翅果油及其亞微乳對小鼠負(fù)重游泳時間及平均延長率的影響（n=10）Table 3 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on the time of load swimming in mice（n=10）

由表3可知，翅果油中劑量組小鼠，平均負(fù)重游泳時間比對照組延長32%，組間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）：高、低劑量組與陰性對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。數(shù)據(jù)表明翅果油發(fā)揮緩解疲勞作用與劑量相關(guān)，且中劑量組具有一定的緩解運(yùn)動體力疲勞之作用。翅果油亞微乳試驗組與陰性對照組比較，結(jié)果雖不具統(tǒng)計學(xué)意義，但結(jié)果均高于低、高劑量組和陰性對照組，表明將其制備成亞微乳后可增強(qiáng)吸收，有利于提高其生物利用度，有益于延長游泳時間，表現(xiàn)出一定的緩解體力疲勞之功效。

3.4 小鼠運(yùn)動后生化指標(biāo)的測定結(jié)果

3.4.1 小鼠運(yùn)動后BUN的測定結(jié)果

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，對不同組別小鼠游泳后即刻（0 min）、游泳后休息60分鐘后，血清尿素氮的含量及清除速率測定結(jié)果，進(jìn)行分析。結(jié)果見表4。

表4 翅果油及其亞微乳對小鼠BUN含量和清除速率測定結(jié)果（n=10）Table 4 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on blood BUN content in mice（n=10）

表4可知：中劑量組小鼠泳后60 min時的BUN含量比對照組顯著降低，BUN清除速率是對照組的13.2倍，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；高、低劑量組的BUN的含量與對照組相比，清除速率分別為對照組的1.8倍和2.1倍，但均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。亞微乳組與對照組相比，清除率均略高于低、高劑量組和對照組（P＞0.05），表明將其制備成亞微乳后可增強(qiáng)其吸收。數(shù)據(jù)表明，翅果油及其亞微乳能夠降低小鼠持續(xù)高強(qiáng)度運(yùn)動后體內(nèi)產(chǎn)生的BUN含量，清除BUN的積累，有助于提升運(yùn)動能力。

3.4.2 小鼠運(yùn)動后BLA的測定結(jié)果

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，對各試驗組小鼠游泳后不同時刻血乳酸的含量測定結(jié)果及清除速率，進(jìn)行分析。分析結(jié)果見表5。

由表5分析結(jié)果可知：翅果油中劑量組的小鼠，血乳酸的清除速率是對照組的5.5倍，顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；高、低劑量組的清除速率分別是 0.5倍、1.6倍，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）：亞微乳組與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但清除率均略高于低、高劑量組和對照組，表明將其制備成亞微乳后可增強(qiáng)其吸收。結(jié)果表明小鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物乳酸的消除與翅果油的劑量相關(guān)。且中劑量組對乳酸的消除具有高表達(dá)。

表5 翅果油及其亞微乳對小鼠BLA含量和清除率測定結(jié)果（n=10）Table 5 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on blood LA content in mice（n=10）

3.4.3 小鼠運(yùn)動后LG的測定結(jié)果

依據(jù)SPSS17.0統(tǒng)計軟件，對不同組別小鼠的肝糖原的含量結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果見表6。

表6 翅果油及其亞微乳對小鼠游泳后肝糖原含量的影響（n=10）Table 6 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on hepatic glycogen content in mice（n=10）

由表6結(jié)果看出，與對照組比較，翅果油中劑量組小鼠泳后0 min和泳后休息60 min時，肝糖原的含量分別相對增加36.3%、35.6%，明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；高、低劑量組的肝糖原的含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；亞微乳組與對照組相比，LG相對增加量均略高于翅果油低、高劑量組（P＞0.05），表明將其制備成亞微乳后可增強(qiáng)其吸收，提高其生物利用度。結(jié)果表明：適量的翅果油通過提高肝糖原的儲備，抑制能量消耗，從而具有增進(jìn)體能和緩解體力疲勞的作用。

4 討論與結(jié)論

基于單因素試驗和正交試驗設(shè)計成功制備出翅果油亞微乳。該劑型不僅可以掩蓋翅果油本身滋膩礙胃的口感和油樣氣味，還具有吸收效果好、口感好、生物利用度高、安全性和靶向性等作用。同時，亞微乳在正常組織中的分布很少，明顯減輕藥物的不良反應(yīng)及毒副作用，進(jìn)而達(dá)到高效低毒的特點(diǎn)。這種新劑型為翅果油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了很好的契機(jī)，具有一定的市場應(yīng)用前景。

通過建立小鼠力竭游泳試驗?zāi)Ｐ?，并結(jié)合肝糖原、乳酸、血清尿素氮等生化指標(biāo)，研究翅果油及實驗室自制亞微乳緩解運(yùn)動性疲勞的影響。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)》中規(guī)定，若1項以上（含1項）運(yùn)動試驗和2項以上（含2項）生化指標(biāo)為陽性，即可以判斷受試物具有緩解體力疲勞的作用。試驗結(jié)果顯示，中劑量翅果油可以顯著地延長小鼠負(fù)重游泳的時間；增加小鼠肝糖原的儲備量，降低劇烈體力勞動后糖原的消耗；對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮的積累具有明顯的抑制及清除作用；對小鼠運(yùn)動后血乳酸具有明顯清除作用。我們的研究中由于翅果油亞微乳的載油量為5%（相當(dāng)于翅果油低劑量組載油量），且小鼠的灌胃容量有限，導(dǎo)致亞微乳無法達(dá)到和翅果油中、高劑量相同載油量的灌胃體積。但翅果油亞微乳各項指標(biāo)均優(yōu)于翅果油低、高劑量組和陰性對照組，表明將其制備成亞微乳后，可以增加其吸收，提高其生物利用度。

肝糖原是機(jī)體重要的能源物質(zhì)。劇烈運(yùn)動后葡萄糖耗盡，肝糖原隨之分解入血，補(bǔ)充機(jī)體能量所需并維持血糖恒定[1]。若肝糖原耗竭，機(jī)體供能不足，就會產(chǎn)生疲勞[14]。所以增加肝糖原儲備，有利于延緩疲勞發(fā)生。本文結(jié)果表明，翅果油可能是通過提高運(yùn)動后小鼠肝糖原的儲備，為機(jī)體提供更多的運(yùn)動耐力能量來發(fā)揮抗疲勞作用。乳酸是機(jī)體通過葡萄糖的無氧糖酵解產(chǎn)生的代謝終產(chǎn)物[15]。劇烈運(yùn)動時，機(jī)體以無氧呼吸為主，其代謝產(chǎn)物乳酸會破壞酸堿平衡，使水鹽代謝紊亂，進(jìn)而引起疲勞[13]。乳酸積聚越多，疲勞感越嚴(yán)重，乳酸清除越徹底，疲勞恢復(fù)越快[16]。研究結(jié)果表明，翅果油可能是通過加速運(yùn)動后小鼠血乳酸的清除，有利于其疲勞的恢復(fù)，從而緩解其疲勞感。血尿素氮是評價機(jī)體運(yùn)動能力、負(fù)荷能力較為靈敏的重要指標(biāo)[17]。機(jī)體高強(qiáng)度運(yùn)動后，糖與脂肪的分解代謝，不足以提供足夠的能量時，蛋白質(zhì)會分解，其代謝產(chǎn)物為尿素氮，它含量越高，表明疲勞越嚴(yán)重。本試驗結(jié)果表明，翅果油可能是通過抑制蛋白質(zhì)的分解，減少運(yùn)動后小鼠血清尿素氮的積累，增強(qiáng)運(yùn)動耐力從而緩解疲勞作用。

本文對翅果油及其亞微乳緩解運(yùn)動性疲勞及機(jī)制進(jìn)行了初步探討，然而，翅果油中功效成分復(fù)雜多樣，富含不飽和脂肪酸、維生素E、植物甾醇和蛋白質(zhì)等，但其抗疲勞作用究竟是單一組分還是多種化合物的綜合作用結(jié)果有待于進(jìn)一步研究。

本文制備出了一種安全性好，口感俱佳的翅果油亞微乳。該翅果油能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間，同時降低小鼠運(yùn)動后血乳酸、血清尿素氮的蓄積，提高肝糖原的儲備，具有一定的緩解運(yùn)動性疲勞作用。本研究對于翅果油進(jìn)一步研發(fā)新型的功能產(chǎn)品提供一種新的思路，具有一定的實際應(yīng)用價值及應(yīng)用前景。

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