陳笛，陳健，高健，曹獻(xiàn)英

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

抗氧化肽（Antioxidative Peptides，AP）是生物活性肽（Bioactive Peptides，BP）中具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和清除體內(nèi)自由基功效的肽類(lèi)總稱(chēng)[1-2]。來(lái)源于食源蛋白的AP，不僅具有不錯(cuò)的抗氧化活性和極高的安全性，而且可以溶于油水兩相，因而在抗氧化類(lèi)保健食品、生物醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域有較為廣闊應(yīng)用前景[3]。因此，利用食源蛋白制備的抗氧化肽不但可以提高人類(lèi)的健康品質(zhì)，而且無(wú)副作用。研究發(fā)現(xiàn)，一些肽的活性與其分子量、氨基酸種類(lèi)、排列方式及構(gòu)象有著密切關(guān)系[4]。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)海馬研究的深入，海馬作為制備功能食品的原料受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前研究對(duì)海馬的研究只限于藥理活性和初步加工方面，如保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[5]，增強(qiáng)免疫力作用[6]，抗血栓作用[7]等作用。本試驗(yàn)選用海南養(yǎng)殖的線(xiàn)紋海馬作為制備抗氧化活性肽的原料，采用超氧陰離子、DPPH自由基和羥自由基的清除率作為體外抗氧化活性指標(biāo)，考查不同分子量范圍內(nèi)多肽的抗氧化效果，為在工業(yè)化生產(chǎn)海馬類(lèi)產(chǎn)品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

線(xiàn)紋海馬：海南龍盛生物科技發(fā)展有限公司；中性蛋白酶 BR（50 U/mg）、堿性蛋白酶 BR（200 U/mg）、木瓜蛋白酶BR（800 U/mg）：北京索萊寶生物；牛血清蛋白、鐵氰化鉀（329.25）、卡那霉素（582.58 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da）、溶菌酶（14 400 Da）、Sephadex G25、結(jié)晶紫、硫酸亞鐵等：南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYYB-10真空冷凍干燥機(jī)：上海德洋意邦儀器；FZ102微型植物試樣粉碎：上?？坪銓?shí)業(yè)；AUW22分析天平：日本島津儀器有限公司；Master Series超純水系統(tǒng)：上海和泰儀器有限公司；LNK860自動(dòng)凱氏定氮儀：山東綠能儀器科技；IKARRU10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：金壇市盛藍(lán)儀器；EMF-50LE立式壓力蒸汽滅菌鍋：艾德生儀器。

1.3 方法

1.3.1 海馬多肽的制備

先對(duì)線(xiàn)紋海馬預(yù)處理，將其清洗干凈，凍結(jié)后冷凍干燥，將凍干后的海馬粉碎后過(guò)40目篩，得到的即為海馬凍干粉。將海馬凍干粉參照索氏提取法進(jìn)行脫脂處理，方法參照GB/T 9695.7-2008《肉與肉制品總脂肪含量測(cè)定》。脫脂條件為提取劑：石油醚（60℃～90 ℃），水浴溫度：65 ℃，料液比：1∶8（g/mL），脫脂時(shí)間：4 h。稱(chēng)取1.5 g經(jīng)脫脂處理的海馬粉置于燒杯中，加入30 mL超純水后，95℃水浴加熱10 min。待樣品冷卻至所需的酶解溫度后，酸堿調(diào)節(jié)至所需pH值，再加入E/S為3%的堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解3 h后，90℃水浴15 min，水浴冷卻至室溫，酸堿調(diào)節(jié)至中性后，使用超純水定容至50 mL。將酶解液于9 000 r/min離心20 min，傾出上清液冷藏備用。

1.3.2 Sephadex G25凝膠層析分離條件的確定

所采用的填料類(lèi)型為濕法自然沉降法，柱子規(guī)格為φ1.0 cm×50 cm，脫氣處理的超純水為洗脫劑?？疾椴煌疵摿魉?、上樣體積和上樣濃度對(duì)層析分離效果的影響，從而確定最佳分離條件。

1.3.3 海馬多肽的分離

采用濕法自然沉降法裝填Sephadex G25凝膠柱，用脫氣處理的超純水平衡裝好的凝膠柱。將酶解液濃縮調(diào)整至上樣濃度25 mg/mL，上樣量為0.1 mL，洗脫劑為脫氣處理的超純水，洗脫流速為0.4 mL/min，設(shè)定紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，繪制洗脫曲線(xiàn)。并分別按 35 min～40 min、40 min～45 min、45 min～50 min和50 min～55 min 4個(gè)時(shí)間段分管收集洗脫液，冷凍干燥后的樣品配制成1.0 mg/mL，進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定

取1 mL樣品溶液與1 mL 50 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液混勻，25℃避光水浴30 min，測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)下的吸光度[10]。按照下式計(jì)算樣品液的清除率。

式中：Ai為樣品溶解加入DPPH溶液的吸光度；Ac為無(wú)水乙醇代替樣品溶液加入樣品溶液的吸光度；Aj為無(wú)水乙醇代替DPPH溶液加入樣品溶液的吸光度。

1.3.5 超氧陰離子清除率的測(cè)定

分別取1.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）、0.1 mL樣品溶液和0.1 mL 45 mmol/L的鄰苯三酚迅速混勻，立即在325 nm波長(zhǎng)下，每隔30秒讀取吸光度，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度的變化曲線(xiàn)，計(jì)算吸光度的變化率F1。以超純水代替樣品作對(duì)照，計(jì)算吸光度的變化率F0[10]。按照下式計(jì)算樣品液的清除率。

式中：F1為樣品溶解阻止鄰苯三酚自氧化的速率；F0為鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.6 羥自由基清除率的測(cè)定

向25 mL容量瓶中分別加入3.5 mL 0.02 mmol/L的結(jié)晶紫溶液、2.5 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液、1.0 mL 1%的H2O2溶液和2.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH5.5），混勻后用超純水定容后搖勻，靜置5min后，再加入1.25mL樣品溶液，靜置10 min后，在588 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A2。按照下式計(jì)算樣品液的清除率[10]。

式中：A0為容量瓶中不加 FeSO4和 H2O2；A1為容量瓶中不加樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex G25凝膠層析柱分離效果的影響因素

2.1.1 洗脫流速對(duì)Sephadex G25凝膠層析柱分離效果的影響

采用脫氣后的超純水為洗脫劑，在海馬酶解液蛋白濃度為25 mg/mL，上樣量為0.1 mL，設(shè)定紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為215 nm，調(diào)節(jié)流速分別為0.3 mL/min和0.4 mL/min分別進(jìn)行洗脫，根據(jù)洗脫圖譜分析分離效果最佳的洗脫流速見(jiàn)圖1。

圖1 不同洗脫流速對(duì)Sephadex G25層析柱分離效果的影響Fig.1 Effect of different elution flow rates on Sephadex G25 column separation

由圖1可知，提高洗脫液流速會(huì)使產(chǎn)物提前出峰，從而減少洗脫時(shí)間，這是因?yàn)樘岣呦疵撘毫魉倏梢蕴岣吣z空隙中樣品中各組分物質(zhì)的流動(dòng)速度，從而縮短出峰時(shí)間。0.3 mL/min下的分離效果不佳，其原因是流速過(guò)小導(dǎo)致樣品中組分?jǐn)U散作用加劇，從而影響組分分離效果。洗脫劑流速是影響Sephadex G25凝膠層析柱分離效果的因素之一，過(guò)大的流速會(huì)導(dǎo)致各組分間的分離效果不明顯，但過(guò)小的流速會(huì)因?yàn)榻M分間的擴(kuò)散作用加劇而影響分離效果，同時(shí)，小流速下也會(huì)使分離時(shí)間加長(zhǎng)以及降低洗脫產(chǎn)物的濃度，加大去除溶劑的成本，浪費(fèi)時(shí)間和能源成本[11]?？紤]到各組分的分離效果及分離時(shí)間，選擇0.4mL/min作為洗脫液流速。

2.1.2 上樣量對(duì)Sephadex G25凝膠層析柱分離效果的影響

在海馬酶解液蛋白濃度為25 mg/mL，洗脫流速為0.4 mL/min，設(shè)定紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為215 nm，調(diào)節(jié)上樣量分別為0.10、0.15 mL和0.20 mL分別進(jìn)行洗脫，根據(jù)洗脫圖譜分析分離效果最佳的上樣量見(jiàn)圖2。

圖2 不同上樣量對(duì)Sephadex G25層析柱分離效果的影響Fig.2 Effect of different loading on Sephadex G25 column separation

由圖2可知，增加上樣量，層析柱的分離效果有所下降，當(dāng)上樣量為0.15 mL和0.20 mL時(shí)，峰高趨平，分離效果差。上樣量為0.10 mL時(shí)，分離效果最好。這是因?yàn)樯蠘恿繉?duì)層析分離效果也有較大的影響，如果上樣過(guò)多，則在有限的柱效下不同組分物質(zhì)分離不完全，導(dǎo)致分離效果差；上樣過(guò)少，純化得到的各組分量少，試驗(yàn)效率低[11]。

2.1.3 上樣濃度對(duì)Sephadex G25凝膠層析柱分離效果的影響

采用脫氣后的超純水為洗脫劑，在洗脫流速為0.4 mL/min，上樣量為0.10 mL，設(shè)定紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為215nm，調(diào)節(jié)海馬酶解液蛋白濃度分別為10、25 mg/mL和50 mg/mL分別進(jìn)行洗脫，根據(jù)洗脫圖譜分析分離效果最佳的上樣濃度見(jiàn)圖3。

圖3 不同上樣濃度對(duì)Sephadex G25層析柱分離效果的影響Fig.3 Effect of different loading concentration on Sephadex G25 column separation

由圖3可知，增大上樣濃度，會(huì)降低層析柱的分離效果，當(dāng)上樣濃度增加至25 mg/mL時(shí)，吸光度響應(yīng)值明顯增高，分離效果有所下降，但可提高洗脫物質(zhì)濃度，提高試驗(yàn)效率。但是當(dāng)上樣濃度增加至50 mg/mL時(shí)，會(huì)明顯降低層析柱的分離效果。在凝膠層析分離過(guò)程中會(huì)不斷稀釋樣品，因此需要在不影響分離效果的情況下盡可能增大上樣樣品的濃度。但是，增加上樣濃度時(shí)，樣品的黏度隨之增加，影響樣品中各組分物質(zhì)在凝膠中的流動(dòng)，從而降低凝膠層析的分辨率。因此，選擇25 mg/mL為上樣濃度。

2.2 酶解液及各洗脫組分對(duì)3種自由基清楚效果

2.2.1 酶解液及各洗脫組分對(duì)DPPH自由基清除效果

酶解液及不同組分對(duì)DPPH自由基清除率見(jiàn)圖4。

圖4 酶解液及不同組分對(duì)DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of the hydrolyzate and the different components

圖 4結(jié)果表明，P1（0.43 kDa～1.09 kDa） 和 P2（1.09 kDa～2.78 kDa）對(duì)DPPH自由基的清除率分別為11.25%和10.77%，明顯高于酶解液及其他組分，而P1的活性又略高于P2。P1組分對(duì)DPPH自由基的清除率約為P4組分的2倍，這說(shuō)明低分子量的線(xiàn)紋海馬多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)更優(yōu)異。其中，H（酶解液）對(duì)DPPH自由基的清除能力也優(yōu)于P4，這是因?yàn)榇置敢褐泻蠵1和P2組分，使得其表現(xiàn)出較好的清除效果。

2.2.2 酶解液及各洗脫組分對(duì)超氧自由基清除效果

酶解液及不同組分對(duì)超氧自由基清除率見(jiàn)圖5。

由圖5結(jié)果表明，P1（0.43 kDa～1.09 kDa）和P2（1.09 kDa～2.78 kDa）對(duì)超氧自由基的清除率分別為67.35%和61.73%，明顯高于酶解液及其他組分，而P1的活性略強(qiáng)于P2。P4的清除能力明顯低于其他組分，P1組分對(duì)超氧自由基的清除率約為P4組分的2倍，這說(shuō)明低分子量的線(xiàn)紋海馬多肽對(duì)超氧自由基的清除能力表現(xiàn)更優(yōu)異。

圖5 酶解液及不同組分對(duì)超氧自由基清除率Fig.5 Superoxide free radical scavenging rate of the hydrolyzate and the different components

2.2.3 酶解液及各洗脫組分對(duì)羥自由基清除效果

酶解液及不同組分對(duì)羥自由基清除率見(jiàn)圖6。

圖6 酶解液及不同組分對(duì)羥自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rate of the hydrolyzate and the different components

由圖6結(jié)果表明，P1（0.43 kDa～1.09 kDa）和 P2（1.09 kDa～2.78kDa）對(duì)羥自由基的清除率分別為8.27%和9.73%，明顯高于酶解液及其他組分，P1的活性反而弱于P2，這說(shuō)明P2中包含多種對(duì)羥自由基清除能力較好的肽類(lèi)物質(zhì)。而其他組分對(duì)羥自由基的清除能力均表現(xiàn)一般。

通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，P1（0.43 kDa～1.09 kDa）和P2（1.09 kDa～2.78 kDa）對(duì)DPPH、超氧和羥自由基的清除能力均優(yōu)于其他組分，而P1和P2的分子量又低于P3和P4，這與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道相一致。Jeon等采用從金槍魚(yú)中提取的蛋白酶水解鱈魚(yú)制得5 kDa約是10 kDa組分的抗氧化能力的2倍，表明了小分子量肽具有更好的抗氧化性能力[12]。Kim等分別采用多種蛋白酶水解牛皮明膠制得的P1（1.5 kDa～4.5 kDa）的抗氧化效果明顯優(yōu)于P2（4.5 kDa）組分[13-14]。林琳等水解魷魚(yú)皮膠原蛋白分離出3個(gè)組分P1（2 kDa）、P2（2 kDa～6 kDa）和P3（10 kDa），其中P1組分對(duì)超氧和羥自由基的清除效果顯著優(yōu)于P2和P3組分[15]。Onuh等報(bào)道了小分子量肽的氧自由基清除能力優(yōu)于大分子量，并推測(cè)可能是小分子量肽更容易與自由基結(jié)合發(fā)揮供電子的能力[16]。韋緒芹等指出，AP的活性與其分子量大小密切相關(guān)，研究證明，低分子量多肽的抗氧化活性要比高分子量的活性好，低分子量多肽可能更有效地通過(guò)生物膜，并接近作用靶標(biāo)清除自由基[8]。Fernanda等采用Alcalase酶解亞麻籽蛋白分離出6個(gè)肽段組分，F(xiàn)6（＜1 500 Da）組分的氧自由基清除效果明顯高于其他組分[17]。

3 結(jié)論

本文采用Sephadex G25凝膠層析法對(duì)線(xiàn)蚊海馬蛋白酶解液進(jìn)行分離純化，最終確定0.4 mL/min的洗脫流速、25 mg/mL的上樣濃度和0.10 mL的上樣量為最佳分離條件；多肽分子量0.43 kDa～2.78 kDa范圍內(nèi)的組分對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子和羥自由基的清除能力明顯強(qiáng)于分子量大于2.78 kDa的組分。其中，P1（0.43 kDa～1.09 kDa）組分對(duì)DPPH和超氧自由基的清除能力約是P4（7.09 kDa～18.07 kDa）組分的2倍。

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