鄭滿榮，呂曉玲，王建新，王璐瑤，吳亞平，馮健峰

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

沙棘，又叫醋柳、酸刺、黑刺、沙棗，為胡頹子科沙棘屬植物，是一種落葉性灌木。主要分布于歐洲，高加索，小亞細(xì)亞和中亞，西伯利亞，中國。在西歐，沙棘主要生長在沙灘、沙丘和山坡上。在中亞地區(qū)，主要生長在干燥和沙質(zhì)的地區(qū)[1-2]。根據(jù)研究報(bào)道，沙棘油富含不飽和脂肪酸、維生素、三萜、甾體類化合物及微量元素等206種對人體有益的活性物質(zhì)，具有抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體活力及抗癌等特殊藥理性能，并有促進(jìn)傷口愈合、緩解冠心病和心絞痛等保健功能[3]。市場銷售的沙棘油主要有3種：沙棘籽油、沙棘果油和沙棘全果油，由于提取部位的不同，其生物學(xué)功能可能存在差異。本研究比較了沙棘籽油、果油和全果油的主要成分及抗氧化活性，為其應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

沙棘籽油、沙棘果油、沙棘全果油：山西五臺山沙棘制品有限公司。

棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸甲酯化標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；正己烷：色譜純、其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

7890A氣相色譜儀：美國Aglilent公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；756PC紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 3種沙棘油的理化性質(zhì)測定

皂化值參照GBT 5534-2008《動植物油脂皂化值的測定》的方法進(jìn)行測定；過氧化值參照LS/T 6106-2012《動植物油脂過氧化值測定自動滴定分析儀法》的方法進(jìn)行測定；酸價參照GB 5009.229-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價的測定》進(jìn)行測定。

1.3.2 3種沙棘油脂肪酸成分分析

1.3.2.1 樣品處理方法

取5 g左右的沙棘籽油于三頸燒瓶中，醇油比（95%乙醇∶沙棘果油，mL/g）2∶1及一定量 KOH 置于恒溫水浴鍋上，開啟磁力攪拌，然后于80℃的水浴中回流皂化2 h。皂化結(jié)束后，迅速冷卻，再加入一定量的水和石油醚萃取兩次。萃取液的上層即含有不皂化物的醚層，萃取液的下層即含有脂肪酸鉀鹽的水層用3 mol/L的HCl酸化至pH值為1，再用一定量的石油醚萃取脂肪酸。溶有脂肪酸的石油醚用無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉石油醚，即得游離脂肪酸[4]。

取脂肪酸樣品 200 μL（0.15 g～0.18 g），置于 10 mL具塞試管內(nèi)。移液管量取2 mL 4%（體積比）的硫酸-甲醇溶液加入到具塞試管中，在75℃水浴中加熱反應(yīng)1 h以甲酯化。反應(yīng)完畢后，加入2 mL正己烷，5 mL超純水，振蕩試管，靜置20 min分層。吸取上層清液，以無水Na2SO4干燥，過有機(jī)濾膜（0.22 μm）過濾至離心管待測[5]。

1.3.2.2 氣相色譜法分析

氣相色譜柱：HP-88（100 m×0.25 μm×0.2 μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：270℃；流速：1 mL/min；分流比：30∶1；進(jìn)樣量：2 L。

升溫程序：

1.3.3 總酚含量測定

1.3.3.1 總酚的提取

參照王艷等[6]的方法，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的情況作出修改：將10 mL甲醇與5 g沙棘油混勻，渦旋混勻10 min。甲醇相分離并過濾，沙棘油相以同樣的條件重復(fù)萃取2次，合并甲醇相待測。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取沒食子酸，用4%碳酸鈉定容至250 mL容量瓶，使之溶液濃度為0.1 mg/mL。準(zhǔn)確量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 20 mL 有刻度的具塞試管中，加入1 mL Folin-Ciocalteau試劑，充分搖晃，1 min后加入4%碳酸鈉溶液定容至20 mL。75℃水浴加熱10 min，冷卻后，于760 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 待測液多酚含量測定

移取多酚提取液0.2 mL于20 mL具塞刻度試管，加入l mL Folin-Ciocalteau試劑，再加入4%碳酸鈉溶液并定容至20 mL，搖勻。75℃水浴10 min。冷卻后，于760 nm測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其濃度。結(jié)果以GAE（mg/g）表示，即多酚含量相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)毫克數(shù)的沒食子酸。平行測定3次，以平均值表示總酚含量。

1.3.4 體外抗氧化能力的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力

1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基和具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光法進(jìn)行定量分析。

稱取一定量的沙棘油，分別用無水乙醇配成濃度為 2、4、8、16、20 mg/mL 的待測溶液，吸取待測溶液2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液2.0 mL，搖勻，放置30 min。以無水乙醇調(diào)零，測定517 nm處的吸光值A(chǔ)樣品。同時，測定樣品溶液2.0 mL與無水乙醇2.0 mL混合液在517 nm處的吸光度A對照，再測定2.0 mL DPPH·乙醇溶液與2.0 mL無水乙醇在517 nm處的吸光值A(chǔ)空白。平行測定3次，以平均值繪圖[7]。以VC為陽性對照，臨用前以蒸餾水配制成與沙棘油溶液同等質(zhì)量濃度的對照液。蒸餾水做空白對照。做3次平行。對DPPH自由基的清除率按下式計(jì)算：

1.3.4.2 還原力的測定

采用三氯乙酸法測定。準(zhǔn)確稱取1.0 g沙棘油，用乙醇定容至100 mL，配置成20 mg/mL的母液備用。將10 mg/mL的沙棘油用乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為2、4、8、16、20 mg/mL 沙棘油各 1 mL，加入 2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合后，于50℃放置20 min，加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，在4 800 r/min條件下離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，在波長700 nm處測定吸光度。以VC為陽性對照，臨用前以蒸餾水配制成與沙棘油溶液同等質(zhì)量濃度的對照液。蒸餾水做空白對照。平行測定3次，以平均值繪圖[8]。

1.3.4.3 總抗氧化能力的測定

用95%的乙醇溶解樣品，稀釋至不同濃度，取各濃度的樣品溶液300 μL，然后依次加入1 mL的0.6 mol/L的H2SO4溶液，28 mmol/L的Na3PO4溶液，4 mmol/L的鉬酸銨溶液，95℃水浴中反應(yīng)90 min后，在695 nm下測吸光度值。以VC為陽性對照，臨用前以蒸餾水配制成與沙棘油溶液同等質(zhì)量濃度的對照液。蒸餾水做空白對照。平行測定3次，以平均值繪圖[9]。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率的測定

1）ABTS工作液的配制

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)情況將崔同[10]的方法稍加修改。將ABTS溶于乙醇中制備成7 mmol/L的溶液；取5 mL ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜12-16 h以產(chǎn)生ABTS+·，使用前用乙醇稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02，即得到 ABTS 工作液。

2）測定方法

取不同濃度的樣品液400 μL，加入ABTS工作液3.6 mL，準(zhǔn)確反應(yīng)1 min后在734 nm下測定吸光度記為A樣品，無水乙醇作試劑空白對照，吸光度值記為A對照。以VC為陽性對照，臨用前以蒸餾水配制成與沙棘油溶液同等質(zhì)量濃度的對照液，蒸餾水做空白對照。平行測定3次，以平均值繪圖。按式（2）計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種沙棘油理化性質(zhì)比較

3種沙棘油的理化性質(zhì)如表1所示。

表1 3種沙棘油的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of three kinds of seabuckthorn oil

3種油脂的酸價、皂化值、過氧化值均符合國家食用油相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。酸價以沙棘籽油較高，沙棘果油較低：過氧化值以沙棘籽油較低，沙棘果油較高：皂化值以沙棘果油較低，沙棘全果油較高。

2.2 3種沙棘油脂肪酸成分分析

圖1中5種脂肪酸分別為亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸和棕櫚酸的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，各保留時間分別為32.58、30.22、28.33、27.07 min 和 22.75 min。

圖1 5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatogram of five kinds standard fatty acid

按照1.3.2方法測定3種沙棘油的主要脂肪酸含量，色譜圖見圖2～圖4。由圖可知，3種沙棘油中主要有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等脂肪酸。其中各脂肪酸含量如表2沙棘油脂肪酸成分所示，沙棘籽油和沙棘全果油的主要脂肪酸為油酸、亞油酸和亞麻酸，而沙棘果油的主要脂肪酸為油酸和亞麻酸。3種沙棘油的飽和脂肪酸的含量相近，分別為11.04%、12.32%、11.31%：3種沙棘油脂肪酸含量的區(qū)別主要在于亞油酸和亞麻酸，沙棘籽油含量約為64.52%、沙棘果油含量約為58.02%、沙棘全果油含量約為60.46%，其中以沙棘果油的亞油酸含量最高，以沙棘籽油的亞麻酸含量最高。這與薄海波等[11]的試驗(yàn)結(jié)果存在著一定差異，可能是由于沙棘果的產(chǎn)地及品種的不同以及不同的提取條件都對沙棘油的脂肪酸含量有著不同的影響。

圖2 沙棘籽油的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of seabuckthorn seed oil

圖3 沙棘果油的氣相色譜圖Fig.3 The gas chromatogram of seabuckthorn fruit oil

圖4 沙棘全果油的氣相色譜圖Fig.4 The gas chromatogram of Seabuckthorn total fruit oil

表2 沙棘油脂肪酸成分Table 2 Fatty acid composition of sea buckthorn oil%

2.3 3種沙棘油總酚含量比較

2.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線方程見圖5。

圖5 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of gallic acid

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，可得3種沙棘油的總酚含量，結(jié)果如表3所示，沙棘籽油中的總酚含量最多，沙棘果油與沙棘全果油中總酚含量沒有明顯差異。

表3 3種沙棘油的總酚含量Table 3 Total phenolic content of three kinds of seabuckthorn oil

2.4 3種沙棘油體外抗氧化性質(zhì)比較

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力見圖6。

由圖6可以看出，在所取濃度范圍內(nèi)，3種沙棘油的DPPH自由基清除率均隨著濃度的升高而升高，在0～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)，三者隨濃度增加，清除率增加迅速，在10 mg/mL～20 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，清除率逐漸趨于平緩，且清除率接近100%，但在相同濃度范圍內(nèi)，VC對DPPH自由基的清除能力沒有明顯變化，接近100%。DPPH自由基清除試驗(yàn)中沙棘籽油的EC50值為4.09 mg/mL，沙棘果油為4.00 mg/mL，沙棘全果油為4.49 mg/mL。其中，沙棘籽油的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比Hung-Chih Ting等[12]略低，因此，3種沙棘油均有良好的清除DPPH自由基的能力，是一種優(yōu)良的自由基抑制劑，可以作為一種天然的抗氧化劑。

圖6 DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging activity

2.4.2 還原能力

還原能力見圖7。

圖7 還原能力Fig.7 Reducing power

抗氧化劑的還原力與抗氧化性之間存在著一定的聯(lián)系。天然抗氧化劑通過將電子或氫原子釋放出來與自由基結(jié)合，來破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在反應(yīng)中，還原劑的存在將Fe3+/鐵氰化物復(fù)合物轉(zhuǎn)化為亞鐵形式時，黃色測試溶液變?yōu)榫G色或藍(lán)色。因此，在700 nm處的吸光度值越大表明還原能力越強(qiáng)。

還原力通常是通過評價天然抗氧化劑給出電子或氫原子的能力進(jìn)行測定。天然抗氧化劑是通過給自由基提供電子或氫原子來打破自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此，物質(zhì)的抗氧化活性在還原力上也有所體現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖7），在3種沙棘油中，沙棘籽油有較強(qiáng)的供電子能力，沙棘全果油次之，相同濃度范圍內(nèi)，VC的還原能力保持不變，且明顯高于3種沙棘油。

2.4.3 總抗氧化能力

采用鉬酸銨法對咖啡酸的總抗氧化能力進(jìn)行測定，抗氧化物質(zhì)可以將Mo（Ⅵ）還原為Mo（Ⅴ），并且在酸性條件下形成綠色Mo（Ⅴ）的磷酸鹽在734 nm處有較強(qiáng)的吸收，吸光度值越大表明抗氧化性越強(qiáng)。

根據(jù)1.3.4.3的方法，將樣品配置成一系列濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，分別測定其在734 nm處的吸光度，吸光度值越大表明該物質(zhì)的抗氧化性越好，在圖8中所取濃度范圍內(nèi)，3種沙棘油的總抗氧化能力均表現(xiàn)出很好的量效關(guān)系，隨著濃度的升高而升高，三者沒有顯著性差異，并顯著低于相同濃度范圍內(nèi)VC的總抗氧化能力。

圖8 總抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant capacity

2.4.4 ABTS+自由基清除能力

在測定體外抗氧化能力時，有兩種不同的方法，一種是基于電子的轉(zhuǎn)移并還原有色物質(zhì)，如ABTS法、DPPH法和FRAP法。另一種則是基于氫原子的轉(zhuǎn)移，如ORAC法，抗氧化劑和底物競爭熱反應(yīng)產(chǎn)生的過氧自由基。在ABTS+自由基反應(yīng)中，抗氧化劑通過抑制藍(lán)綠色的ABTS+自由基的產(chǎn)生來評價抗氧化性。ABTS+自由基清除能力見圖9。

圖9 ABTS+自由基清除能力Fig.9 ABTS+free radical scavenging activity

從圖9可以看出，除沙棘籽油外，沙棘果油和沙棘全果油的ABTS+自由基清除能力均有良好的線性關(guān)系，在0～5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，沙棘籽油的清除率略大于其他兩者，隨后沙棘果油的清除能力逐漸超過沙棘籽油和沙棘全果油的清除能力。ABTS+自由基清除試驗(yàn)中沙棘籽油的EC50值為18.55 mg/mL，沙棘果油為10.90 mg/mL，沙棘全果油為15.14 mg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，在清除ABTS+自由基能力上，沙棘果油＞沙棘全果油＞沙棘籽油。相同濃度范圍內(nèi)，VC對ABTS+自由基的清除能力基本保持不變，維持在100%左右。

3 結(jié)論

3種沙棘油主要含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸這5種脂肪酸，含量各不相同，3種沙棘油脂肪酸含量的區(qū)別主要在于亞油酸和亞麻酸，沙棘籽油含量約為64.52%、沙棘果油含量約為58.02%、沙棘全果油含量約為60.46%，其中以沙棘果油的亞油酸含量最高，以沙棘籽油的亞麻酸含量最高。3種沙棘油均有良好的體外抗氧化活性，具有作為天然抗氧化劑的潛力。

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