王澤盛 田洪磊，王鵬，張芳，未志勝

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆奎屯833200）

馬奶酒（koumiss），又稱為馬酪、馬酒等，是一種自漢朝起就有記載的中國傳統(tǒng)發(fā)酵型乳酒[1]。傳統(tǒng)馬奶酒是新鮮馬奶加入發(fā)酵劑發(fā)酵數(shù)日后，形成的一種具有馬奶獨特香味及濃郁酒香的乳白色發(fā)酵型飲料，后經(jīng)過蒸餾成為透明清亮的酒類飲料。目前我國馬奶酒的主要產(chǎn)地為新疆及內(nèi)蒙古，消費群體主要是當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族，如柯爾克孜族、哈薩克族、圖瓦人、蒙古族等[2]。馬奶酒中富含鈣、鐵、維生素C、維生素B5、葉酸等，長期飲用馬奶酒可以有效的防止血栓、血管硬化、高血壓等現(xiàn)代常見慢性病，同時馬奶酒的酒精含量低，口感獨特，使馬奶酒成為新一代的發(fā)酵型健康飲品[3]。

近年來，國內(nèi)外研究學(xué)者將研究重點集中在對益生菌群分析，發(fā)酵工藝優(yōu)化及安全性評估等方面，Danova等[4]對酸馬奶酒中乳酸菌群進(jìn)行了分離與鑒定；李少英等[5]對馬奶酒中乳酸菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研究：王璐等[6]采用響應(yīng)面法對馬奶酒發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。然而采用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對馬奶酒中揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定及新疆不同地區(qū)馬奶酒的揮發(fā)性物質(zhì)差異對比現(xiàn)鮮有報道。采用頂空固相微物萃取技術(shù)（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）結(jié)合GC-MS分析能夠高效、全面的對馬奶酒中的醇類、酯類、有機(jī)酸類等揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定[7]。同時采用相關(guān)性分析方法對新疆不同地區(qū)馬奶酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，找出不同地區(qū)馬奶酒中共有的揮發(fā)性物質(zhì)，以期能夠得出馬奶酒中關(guān)鍵的“香氣”物質(zhì)。

本研究采用HS-SPME/GC-MS技術(shù)對新疆不同地區(qū)馬奶酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，以期能夠深入研究馬奶酒的揮發(fā)性物質(zhì)的主要構(gòu)成和明晰造成不同地區(qū)馬奶酒發(fā)酵風(fēng)味差異產(chǎn)生的原因，同時為規(guī)范產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)馬奶酒奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

分別從新疆阿爾泰布爾津縣（1號），新疆塔城額敏縣（2號），新疆伊犁昭蘇縣（3號），新疆伊犁新源縣（4號），新疆巴音郭楞蒙古自治州（5號），新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州（6號），新疆哈密市（7號），新疆喀什地區(qū)塔縣（8號）采購馬奶酒作為實驗樣品，編號依次為1～8號（詳見表1）。內(nèi)標(biāo)2-辛醇（內(nèi)標(biāo)濃度為100 ppm），美國Sigma公司，色譜純。

SPME萃取裝置（配有SPME手動進(jìn)樣手柄、75 μm CAR/PDMS/DVB纖維頭）：美國Sigma公司；GC-MS（5977 A-7890B）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

表1 新疆不同地區(qū)馬奶酒采集詳細(xì)信息Table 1 Information about the 8 koumiss from different areas from Xinjiang

1.2 試驗方法

1.2.1 馬奶酒樣品預(yù)處理

為確保不同樣品馬奶酒中揮發(fā)性物質(zhì)的穩(wěn)定性，將采購回的馬奶酒冷藏于4℃待用，檢測前將馬奶酒放置于室溫，待其溫度恢復(fù)至室溫（約25℃），再進(jìn)行檢測。

1.2.2 HS-SPME萃取

萃取頭老化：將萃取纖維頭（75 μm CAR/PDMS/DVB）在GC-MS進(jìn)樣口于250℃老化15 min。

取5mL馬奶酒樣品于15mL頂空瓶內(nèi)，加入10μL 2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物，頂空瓶至于頂空固相微物萃取器水浴平臺上，將萃取針插入頂空瓶，在45℃下吸附30 min。吸附后，迅速插入250℃進(jìn)樣口熱解析7 min，同時啟動氣相色譜-質(zhì)譜儀采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 GC-MS測定條件

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×250μm，0.25μm）；升溫程序：初始溫度為40℃，保持5min，以7℃/min的速率升溫至150℃，保持5min，后以7℃/min的速率升溫至230℃，保持5 min，進(jìn)樣口溫度為250℃。載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流進(jìn)樣，接口溫度為250℃。

質(zhì)譜條件：EI電離源；電子能量為70 eV；燈絲電流為80 μA；離子源溫度為230℃：四級桿150℃。無溶劑延遲，scan標(biāo)準(zhǔn)掃描范圍（35 m/z～750 m/z）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

定量分析：為準(zhǔn)確定量，選取2-辛醇為內(nèi)標(biāo)（10μL，內(nèi)標(biāo)濃度），根據(jù)檢出峰面積大小與其質(zhì)量大小等比例得出每種待檢測物質(zhì)的含量，從而得出相應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量濃度[8]。計算公式為：

式中：M1為內(nèi)標(biāo)的含量，μg/mL；M2為目標(biāo)物的含量，μg/mL；R1、R2分別為內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)物的峰面積。

定性分析：分離出的未知物與NIST’14 library相匹配（僅選取匹配度大于80的鑒定結(jié)果）。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)分析

對新疆不同地區(qū)傳統(tǒng)馬奶酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，所得的質(zhì)譜總離子流色譜圖如圖1所示。

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)，檢測出馬奶酒中揮發(fā)性物質(zhì)共38種，共確定了31種揮發(fā)性物質(zhì)。由圖1可以看出不同地區(qū)馬奶酒樣品的色譜峰峰型在同一豐度下?lián)]發(fā)性物質(zhì)種類豐富且整體具有相似性[9]，說明不同地區(qū)的馬奶酒雖然在加工工藝上有一定差異，但由于原料相同，使得最終發(fā)酵而成的馬奶酒在香氣屬性上相似。同時在確定不同地區(qū)馬奶酒具有相似性的情況下，可以通過揮發(fā)性物質(zhì)對比，得出共有物質(zhì)從而確定馬奶酒中關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)組成。

采用內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)合質(zhì)譜定性按出峰時間由低至高排列，最終不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS鑒定結(jié)果見表2。

圖1 新疆不同地區(qū)傳統(tǒng)馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)分析總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile compounds in koumiss form different areas in Xinjiang

表2 不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS鑒定結(jié)果Table 2 Analytical results for GC-MS identification of volatiles in different samples

從所收集的8個不同地區(qū)馬奶酒樣品中共檢測出31中揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括10種酯類，7種酸類，6種醛類，4種烴類，3種醇類，1種酮類（表2）。其中7種物質(zhì)為8種新疆不同地區(qū)傳統(tǒng)馬奶酒所共有，分別是異戊醇、己酸乙酯、壬醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、癸酸。雖然不同地區(qū)馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)種類組成相似，但是每種揮發(fā)性物質(zhì)的相對組成含量卻具有明顯的差異。在通過內(nèi)標(biāo)法（詳見1.3）確定每種揮發(fā)性物質(zhì)含量后計算其相對含量，以期能夠直觀的體現(xiàn)出每種揮發(fā)性物質(zhì)的含量在其整體揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成中所占比例。不同地區(qū)馬奶酒的揮發(fā)性物質(zhì)種類從10～20種不等，種類最多的為1號阿爾泰布爾津縣的圖瓦人馬場自釀的馬奶酒，種類含量最少的為4號伊犁新源縣市場采購的農(nóng)家自釀馬奶酒。馬奶酒所含揮發(fā)性物質(zhì)種類不同直觀的體現(xiàn)為：1號的整體酒味更加豐富，而4號的奶酒香味略顯單一整體香味不夠濃郁。根據(jù)表1數(shù)據(jù)通過AVNOA單因素方差分析[10]，采用Duncan多重比較得出不同地區(qū)馬奶酒中按物質(zhì)大類的各物質(zhì)成分總含量，詳見表3。

續(xù)表2 不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS鑒定結(jié)果Continue table 2 Analytical results for GC-MS identification of volatiles in different samples

表3 新疆不同地區(qū)馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)的總含量Table 3 The total contents of different groups of volatile compounds identified from koumiss samples from different areas in Xinjiang

由表3可以看出，新疆不同地區(qū)的馬奶酒樣品種揮發(fā)性物質(zhì)主要是由酯類和酸類構(gòu)成，兩類揮發(fā)性物質(zhì)相對含量較高，占各地區(qū)馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)總量的86.04%～97.40%，平均百分比為90.98%，酯類和酸類是馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成的最主要的兩類物質(zhì)。酯類占各樣品揮發(fā)性物質(zhì)總量的48.72%～82.81%，平均百分比67.75%。酯類通常具有香甜，令人感到舒適宜人的香氣，多存在水果的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成中，，是各類酒中重要的芳香物質(zhì)之一[11-12]。結(jié)合表2看出，馬奶酒中以乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等乙酯類物質(zhì)居多，同時乙酯類物質(zhì)種又多以碳個數(shù)為10以下的碳鏈乙酯為主，可能是由于馬奶酒種含有大量的乙醇，在乙酰轉(zhuǎn)移酶等多種酶類的共同酶解作用下發(fā)生了酯化反應(yīng)[13]，使得乙酯類含量相對較高。其中含量相對較高的為己酸乙酯和辛酸乙酯，平均含量分別為8.93%和51.15%。酸類物質(zhì)僅次于酯類物質(zhì)，占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的14.23%～42.09%，平均含量為25.23%。其中出現(xiàn)頻次相對較高的酸類物質(zhì)有己酸、辛酸、癸酸。馬奶酒中揮發(fā)性酸類物質(zhì)較高的原因是由于馬奶在發(fā)酵的過程中酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的酸類物質(zhì)，同時在采集到的馬奶酒樣品的感官體驗上酸味十分明顯[14]，酸類物質(zhì)易揮發(fā)、易被萃取的特點使得馬奶酒中揮發(fā)性物質(zhì)檢測含量較高。不同地區(qū)的馬奶酒種酸類物質(zhì)通過差異性分析，得出1～6號樣品差異不顯著具有一定相似性，說明了大部分地區(qū)的馬奶酒酸類物質(zhì)的含量是具有相似性的。這也符合馬奶酒樣品感官體現(xiàn)的結(jié)果。醛類物質(zhì)也是馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成中重要組成部分，占總揮發(fā)性物質(zhì)總量的1.27%～7.12%，平均含量為3.19%，僅次于酸類物質(zhì)。其中壬醛為8組不同地區(qū)馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)中的共有物質(zhì)之一，占總含量的0.92%～4.65%，平均含量為1.93%。醛類物質(zhì)一般具有較低的風(fēng)味閾值，其含量的改變亦可對食品風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響[15]。酮類物質(zhì)在馬奶酒中含量較低，僅檢測出2-壬酮一種酮類物質(zhì)，總量占馬奶酒種揮發(fā)性物質(zhì)的0%～1.01%。

圖2 不同地區(qū)馬奶酒的聚類分析圖Fig.2 Cluster pedigree diagram of volatiles among 8 kinds of koumiss

2.2 不同地區(qū)8種馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析

圖2為在同一度量標(biāo)準(zhǔn)下，按照統(tǒng)平方歐式距離映射后8種不同地區(qū)馬奶酒樣品及其主要類型揮發(fā)性成分聚類分析結(jié)果。

由圖2a可以看出，通過聚類分析可以較好的將新疆不同地區(qū)的8種馬奶酒進(jìn)行區(qū)分。歐氏距離的歸類原則是基于各組樣本間相似程度高低，兩樣本相似性越大，便會在越小的歐氏距離下歸為一類[16]。同一度量標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行聚類分析，以各馬奶酒樣本中所有揮發(fā)性物質(zhì)含量作為聚類依據(jù)，可以由圖2看出8個不同地區(qū)的馬奶酒可以分成2個類群；第一類群在距離為3的時候4、6、7號樣品可以歸為一類，說明這3種馬奶酒的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成相似性較高[17]；當(dāng)歐氏距離為9時，2、3、5、8形成第二類群共4個樣品。結(jié)合表3可以看出這4個地區(qū)的馬奶酒在差異性分析上也顯示的為不顯著；當(dāng)歐氏距離為16時8種不同地區(qū)新疆馬奶酒最終可歸為一類，說明新疆地區(qū)的馬奶酒雖然有一定差異性，但整體揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成上也具有一定相似性，這可能是由于原料的選擇、發(fā)酵劑的差異、發(fā)酵加工方式的不同導(dǎo)致了馬奶酒的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成的區(qū)別。第一類群中的4、6、7號的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成比例相近，其中酯類物質(zhì)的比例都在74%以上，但其它類物質(zhì)的含量相對較低。而第二類群的1、2、3、5、8號馬奶酒，酯類物質(zhì)的含量均低于68%，并且其它揮發(fā)性物質(zhì)如酸、醛、醇類揮發(fā)性化合物種類豐富，含量也相對較高，揮發(fā)性成分的復(fù)雜性可以直接影響馬奶酒的整體風(fēng)味是否醇厚濃郁。從采購方式也可以看出第二類群的樣品多采購與牧民家中或是牧場周邊，而第一類群的馬奶酒采購于市場中，其加工質(zhì)量可能相較于當(dāng)?shù)啬撩褡约裔勗炻燥@不足。同時牧民自釀的馬奶酒多采用自然發(fā)酵，發(fā)酵過程可以不外加菌種，或是直接使用預(yù)留好的“酵頭”直接發(fā)酵，而市場購買的馬奶酒會采用外加商業(yè)菌種的方式進(jìn)行發(fā)酵。同時奶源的品質(zhì)也直接導(dǎo)致了最終馬奶酒的風(fēng)味品質(zhì)。因此沒有規(guī)范的生產(chǎn)工藝直接導(dǎo)致了產(chǎn)品的品質(zhì)不均一，也使得馬奶酒產(chǎn)業(yè)難以規(guī)范化、工業(yè)化。

揮發(fā)性物質(zhì)組成的差異不僅體現(xiàn)在各單一物質(zhì)的含量差異，大類物質(zhì)的改變也會對馬奶酒的風(fēng)味構(gòu)成產(chǎn)生影響，通過對8種樣品中的酯類、酸類、醇類、醛類、酮類、烴類進(jìn)行聚類分析，能夠更為直觀的得出導(dǎo)致不同地區(qū)馬奶酒風(fēng)味差異的關(guān)鍵物質(zhì)種類。由圖2b可知，在標(biāo)度（歐式距離）為4時所有揮發(fā)性物質(zhì)歸為兩大類，在距離達(dá)到25時所有揮發(fā)性物質(zhì)可歸為一類，在同一度量標(biāo)準(zhǔn)下酯類與各大類物質(zhì)間的歐式距離最大，說明酯類物質(zhì)的差異性趨勢較其它幾類物質(zhì)更為顯著[18-19]。造成酯類物質(zhì)差異性的原因可能是由于奶源的品質(zhì)如蛋白，脂肪含量的不同使得最終發(fā)酵后酒精度的差異，使得酯化反應(yīng)程度不同最終導(dǎo)致形成的酯類物質(zhì)含量種類不同。此外馬奶原本的香氣濃郁度也很大程度上決定了最終馬奶酒的整體香味。因此，新疆馬奶酒產(chǎn)業(yè)需要標(biāo)準(zhǔn)化整個生產(chǎn)過程，從最初的奶源選擇，到菌種的篩選以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化相結(jié)合，再通過現(xiàn)代檢測手段精確監(jiān)測其風(fēng)味品質(zhì)，從而達(dá)到馬奶酒產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。

3 結(jié)論

新疆8個不同地區(qū)傳統(tǒng)馬奶酒共檢測出31種揮發(fā)性物質(zhì)，其中7種為8個地區(qū)馬奶酒共有揮發(fā)性成分，分別為異戊醇、己酸乙酯、壬醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、癸酸。馬奶酒中揮發(fā)性成分主要包含酯類、酸類、醛類、醇類、烴類、酮類，其中酯類與酸類物質(zhì)含量種類最多，其次為醛類和醇類物質(zhì)。通過對不同地區(qū)馬奶酒揮發(fā)性成分進(jìn)行聚類分析可以能看出8個不同地區(qū)的馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)存在顯著差異，通過聚類可以分為2個類群，能夠客觀真實的反映了樣品信息的真實性。同時通過對不同大類物質(zhì)的聚類分析得出造成不同地區(qū)馬奶酒差異性的關(guān)鍵物質(zhì)為酯類物質(zhì)，可能是造成馬奶酒樣品不同風(fēng)味的主要因素。通過GC-MS分析得出的馬奶酒揮發(fā)性物質(zhì)組成能夠為馬奶酒工業(yè)化提供理論數(shù)據(jù)，為后期馬奶酒品質(zhì)監(jiān)測提供了參考，具有一定的實用價值。

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