張亞男，陳平平，王洪玉，高 鑫，劉樹民

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，2015版中國(guó)藥典記載黃芩味苦性寒。歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)[1-5]。

中藥的四性（四氣）是指中藥溫?zé)岷疀?種不同的藥性，但也有一部分中藥藥性平和，故現(xiàn)在四氣一般指“寒、熱、溫、涼、平”5種藥性，它反映了藥物影響人體陰陽(yáng)盛衰、寒熱變化方面的作用趨勢(shì)[1]?；诖吮緦?shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠體內(nèi)物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)酶的含量，考察黃芩拆分組分對(duì)其表達(dá)的影響，以初步詮釋黃芩拆分組分的寒熱屬性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取SD種雄性大鼠50只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，動(dòng)物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供[許可證號(hào)：SCXK（黑）2015-004]，室溫為（22±1）℃，相對(duì)濕度為（65±5）%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食飲水。將大鼠隨機(jī)分成5組，空白組，全成分組、苷元組、苷類組、多糖組，每組10只。

1.2 藥物 黃芩生品[河北承德藥材有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：20140623）]。黃芩拆分組分的制備：黃芩飲片加石油醚（料液比 1∶6）超聲 50 min，2 次，抽濾。合并濾液減壓濃縮，揮去石油醚得揮發(fā)油組分；藥渣干燥后，水煎煮，第1煎加入10倍量的蒸餾水提取，第2煎加入8倍量水（兩煎均冷凝回流2 h）,合并兩煎藥液，減壓回收提取液至適當(dāng)濃度，得到全成分。加入95%乙醇（大約5倍量體積），不斷攪動(dòng)，至乙醇的濃度約為80%，靜置24 h（此過(guò)程反復(fù)3～4次），收集沉淀部分，沉淀經(jīng)抽慮，離心后，經(jīng)無(wú)水乙醇，乙醚交替洗滌，自然干燥沉淀得多糖組分；濾液減壓回收至無(wú)醇味，過(guò)D101大孔樹脂，用3倍柱體積的30%乙醇和95%的乙醇進(jìn)行洗脫，分別得到黃芩苷元組分和苷類組分，縮至稠浸膏，凍干，干燥保存待用。

1.3 試劑與儀器 葡萄糖激酶（GCK）、果糖磷酸激酶（PFK）、乙酰輔酶 A（Ac-CoA）、丙酮酸脫氫酶（PDH）、檸檬酸合酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（ICD）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150610）、腺甘酸激酶（ADK）、ATP合成酶（ATPs）、細(xì)胞色素 C 還原酶（CCR）、細(xì)胞色素 C 氧化酶（COX）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150617）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、5-羥色胺（5-HT）、乙酰膽堿（AchE）、去甲腎上腺素（NE）酶聯(lián)免疫試劑盒、超微量Na-K-ATP酶測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150624）。

酶標(biāo)儀M200 PRO（奧地利）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；移液槍（德國(guó)梅特勒-托利多）；水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物的分組及給藥 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d以后，隨機(jī)分為空白組、全成分組、苷元組、苷類組、多糖組，每組10只。全成分組給予（生藥3 g/kg），苷元組（生藥 0.05 g/kg），苷類組（生藥 0.41 g/kg），多糖組（0.42 g/kg），空白組給予等劑量生理鹽水。連續(xù)給藥2周后取心臟、肝臟、肌肉等迅速凍存于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 物質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 取出之前凍存的肝臟組織解凍后，取剪碎的組織0.2 g，按照1∶9的質(zhì)量體積比，加入1.8 mL的生理鹽水，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨，最后將勻漿液以4 000 r/min，離心10 min，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)GCK、PFK、PK、Ac-CoA、PDH、CS、ICD、的含量。

2.3 能量代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 操作方法如上，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè) ADK、ATP、CCR、COX、Na-KATP酶（肌肉）、Na-K-ATP酶（肝臟）的含量。

2.4 內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 取材后的全血樣品于室溫放置2 h或者4℃過(guò)夜后以3 000 r/min離心15 min，取上清液，依據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)T3、T4的含量。

2.5 植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 操作方法如2.4，依據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)5-HT、AchE、NE的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩拆分組分對(duì)正常大鼠物質(zhì)代謝的影響

3.1.1 黃芩拆分組分對(duì)葡萄糖氧化成丙酮酸階段相關(guān)酶表達(dá)情況的影響 見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組大鼠GCK、PFK的表達(dá)下調(diào)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；苷元組GCK顯著下調(diào)（P＜0.05）；苷類組 PFK 顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3.1.2 黃芩拆分組分對(duì)丙酮酸氧化成乙酰輔酶A階段相關(guān)酶表達(dá)情況的影響 見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組大鼠Ac-CoA表達(dá)顯著升高、PDH表達(dá)顯著性下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；苷類組 PDH 顯著下調(diào)（P＜0.05）。

表1 黃芩拆分組分對(duì)大鼠GCK、PFK、PK表達(dá)的影響（x±s）ng/mL

表2 黃芩拆分組分對(duì)大鼠Ac-CoA、PDH蛋白影響（x±s）ng/mL

3.1.3 黃芩拆分組分對(duì)三羧酸循環(huán)過(guò)程相關(guān)酶表達(dá)情況的影響 見(jiàn)表3。結(jié)果可以得出，與空白組比較，全成分組CS、ICD蛋白表達(dá)下調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；苷元組CS蛋白表達(dá)下調(diào)明顯（P＜0.05）。

表3 黃芩拆分組分對(duì)大鼠CS、ICD蛋白的影響（x±s）ng/mL

3.2 黃芩拆分組分對(duì)能量代謝過(guò)程中相關(guān)酶表達(dá)的影響 見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組可顯著性的降低ADK、CCR、NA-K-ATP酶（肝臟）的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；苷元組可明顯降低COX、NA-K-ATP酶（肝臟）的表達(dá)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余指標(biāo)均有回調(diào)趨勢(shì)；苷類組顯著性降低COX蛋白表達(dá)及NA-K-ATP（肌肉）活性（P＜0.05），其余指標(biāo)均有回調(diào)作用；多糖組ATP顯著降低（P＜0.05）。

3.3 黃芩拆分組分對(duì)正常大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)酶表達(dá)的影響 見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組和苷元組T4明顯降低（P＜0.05）；苷類組T3、T4水平降低且具有明顯差異（P＜0.05）。

表4 黃芩拆分組分對(duì)大鼠ADK、ATP、CCR、COX、NA-K-ATP的影響（x±s）

表5 黃芩拆分組分對(duì)大鼠T3、T4的影響（x±s）ng/mL

3.4 黃芩拆分組分對(duì)正常大鼠植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)酶表達(dá)的影響 見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組比較，全成分組大鼠5-HT水平顯著上升（P＞0.05）；苷元組大鼠5-HT水平明顯升高、AchE水平顯著降低（P＜0.05），NE有降低趨勢(shì)但不明顯；苷類組5-HT水平明顯升高、NE水平明顯下降，AchE有降低趨勢(shì)；多糖組5-HT升高，AchE和NE下降，但均不顯。

表6 黃芩拆分組分對(duì)大鼠5-HT、AchE、NE的影響（x±s）

4 討論

王伽伯等[6]提出中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，研究藥性相同或相近的中藥中的一類化學(xué)成分是揭示藥性實(shí)質(zhì)的有效途徑，發(fā)現(xiàn)寒性藥抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性、減弱循環(huán)系統(tǒng)、降低機(jī)體產(chǎn)熱量。王艷艷等[7]發(fā)現(xiàn)具有寒涼藥性的中藥抑制線粒體的能量代謝；溫?zé)崴幣c之相反。黃麗萍等[8-9]提出寒性中藥黃芩抑制能量代謝，抑制NA-K-ATP酶的生成。戴璐[10]通過(guò)觀察寒性中藥黃連和大黃對(duì)實(shí)熱證大鼠物質(zhì)代謝、能量代謝及甲狀腺軸功能的影響，發(fā)現(xiàn)寒涼中藥抑制物質(zhì)代謝、能量代謝及甲狀腺軸功能。滕佳林等[11]也發(fā)現(xiàn)寒性藥使腦內(nèi)5-HT增加，NE減少。黃俊山等[12]發(fā)現(xiàn)寒涼藥抑制甲狀腺激素?？擞萚13]發(fā)現(xiàn)桑白皮拆分組分抑制物質(zhì)能量代謝，推測(cè)其藥性可能為寒涼。SONG等[14]發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)能夠通過(guò)線粒體中的C2C12肌管促進(jìn)糖代謝和脂肪代謝。在前期的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)考察物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，以探討黃芩拆分組分的藥性歸屬。

總體來(lái)說(shuō)黃芩全成分抑制物質(zhì)代謝；苷元和苷類具有與寒涼中藥相同的作用趨勢(shì)，推測(cè)其抑制物質(zhì)代謝；在物質(zhì)代謝階段多糖的作用趨勢(shì)不明顯[15]。

在能量代謝的過(guò)程中，黃芩全成分顯著降低ADK、CCR、COX、NA-K-ATP酶的表達(dá)；對(duì) ATP的影響不明顯，主要可能是三羧酸循環(huán)過(guò)程被抑制，而該過(guò)程是主要生成ATP的過(guò)程，糖原的合成和分解均處于動(dòng)態(tài)過(guò)程提供能量，脂肪分解提供能量以保持機(jī)體的正常功能。由以上指標(biāo)可以推斷出黃芩全成分對(duì)正常大鼠的能量代謝具有抑制作用；通過(guò)部分指標(biāo)的表達(dá)，推測(cè)苷元和苷類具有與寒涼中藥相同的作用趨勢(shì)，推測(cè)其抑制能量代謝；在該過(guò)程中多糖抑制ATP的生成，推測(cè)多糖抑制能量代謝過(guò)程。

黃芩全成分和苷元抑制植物神經(jīng)系統(tǒng)，苷類有抑制傾向，NE和AchE降低，5-HT升高，表現(xiàn)出與寒涼中藥相似的作用趨勢(shì)，由此可以推斷出其黃芩全成分和苷元藥性為寒性，該階段苷類組分和多糖組分的趨勢(shì)不明顯，需要進(jìn)一步證實(shí)。

陳慧等[17]提出中藥寒熱平性質(zhì)與化學(xué)成分的類別及含量有相關(guān)性，在寒性中藥中黃酮類化合物出現(xiàn)的頻率以及含量明顯高于其他化合物，在熱性中藥中萜類和揮發(fā)油出現(xiàn)的頻率以及含量最高，在平性中藥中黃酮類化合物出現(xiàn)的頻率和糖類、萜類和揮發(fā)油相差不大，平性中藥無(wú)寒熱之偏，糖類在寒熱平3種中藥中出現(xiàn)的頻率相差不大。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)黃芩拆分組分對(duì)物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響，推斷出苷元和苷類的藥性為寒，是黃芩藥性為寒的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，多糖的藥性可能為微寒，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

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