沈 鑫，張思泉，張瑩雯，柯浩亮，帥 瑜

（武漢大學(xué)附屬中南醫(yī)院，武漢 430071）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末腎衰竭（ESRD）的主要原因之一[1]。近30年來，隨著世界范圍內(nèi)糖尿病患者的增加，DN發(fā)病率也隨之急劇提高[2]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子參與以及遺傳因素等[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是近年來新發(fā)現(xiàn)的DN發(fā)病機(jī)制，被證實(shí)與DN關(guān)系密切[4-6]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對DN大鼠GRP78-PERK-eIF2α通路的影響，為當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療DN提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量180～210 g，均購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（鄂）2014-0004]。飼養(yǎng)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)房，室溫（22±2）℃，相對濕度60%，每日光照12 h，實(shí)驗(yàn)期間不限飲食和飲水，定期更換敷料，連續(xù)觀察8周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 當(dāng)歸補(bǔ)血湯由當(dāng)歸、黃芪按1∶1配比（前期實(shí)驗(yàn)提示此為治療DN最優(yōu)配比），藥物飲片購自湖北省中藥材公司，當(dāng)歸、黃芪生藥飲片浸水1 h，煮沸40 min，過濾后的藥渣再次加水煮沸，重復(fù)2次，合并煎煮液，在水浴中濃縮，置4℃冰箱備用，按實(shí)驗(yàn)需要再行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮備用。

1.1.3 主要儀器和試劑 超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰），全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝公司），倒置光顯微鏡（Olympus日本），透射電子顯微鏡（日立公司），超薄切片機(jī)（瑞典Bromma公司），臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），PCR儀（杭州博日科技），電泳儀（北京市六一儀器廠），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，溶于0.1 mol/L，pH=4.3的檸檬酸鈉緩沖液中）；RIPA總蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ASPEN）等。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)房，普通飼料和高脂飼料均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室溫20℃，相對濕度60%，每日光照12 h，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間不限飲食和飲水，定期更換敷料，連續(xù)觀察8周。

1.2.2 糖尿病大鼠的分組和造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只為對照組（n=10），喂普通飼料;其余大鼠為造模組（n=50）喂以高脂飼料，大鼠均不限飲食和飲水。1周后，將造模組大鼠禁食12h，并給予一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg（溶于0.1 mmol/L，pH=4.3的檸檬酸鈉緩沖液中），對照組給予相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mmol/L，pH=4.3）一次性腹腔注射，注射48 h后采足底靜脈血，連續(xù)3 d測隨機(jī)血糖，血糖≥16.7 μmol/L視為糖尿病大鼠造模成功[7]。造模組成活且造模成功的大鼠共43只，隨機(jī)選取40只納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為模型組[n=10，生理鹽水10 mL/（kg·d）]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組[高劑量組，n=10，7.14 g/（kg·d）當(dāng)歸補(bǔ)血湯溶縮液]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組[低劑量組，n=10，1.79 g/（kg·d）當(dāng)歸補(bǔ)血湯溶縮液]，格列齊特組[n=10，2.68 mg/（kg·d）格列齊特緩釋片]，以上藥物均通過灌胃方式給藥，對照組（N組）給予生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃給藥，連續(xù)灌胃8周后取材。

1.2.3 一般情況及生化指標(biāo)的檢測 觀察大鼠的精神、毛色、活動(dòng)是否靈活、食量、飲水量、尿量等；實(shí)驗(yàn)第8周末，用代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量并于-80℃冰箱保存；所有大鼠禁食12 h，禁水8 h后，稱量大鼠體質(zhì)量，無菌條件下腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心后取血清，全自動(dòng)生化分析儀測大鼠空腹血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；無菌條件下摘取雙腎。

1.2.4 光鏡及電鏡下觀察腎組織 取小鼠腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，將組織切片按常規(guī)方法進(jìn)行過碘酸雪夫氏染色（PAS）染色，于光鏡200倍視野下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)變化。另取腎皮質(zhì)剪碎用1.25%戊二醛固定，用透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 免疫組化檢測GRP78、PERK、eIF2α蛋白的表達(dá) 取小鼠腎組織于4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，將石蠟切片脫蠟至水后用EDTA緩沖液中微波修復(fù)，置于3%過氧化氫溶液中孵育，甩干后以5%BSA封閉，依次加入稀釋的一抗、相應(yīng)種屬的二抗于保濕盒中孵育，滴加配制DAB，顯微鏡控制顯色，中性樹膠封固后用顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 PCR檢測大鼠腎組織中GRP78 mRNA、PERK mRNA、eIF2α mRNA的表達(dá) 大鼠 GRP78、PERK、eIF2α 引物由 Invitrogen Biotechnology Co.,LTD.中國公司合成；總RNA的提取按試劑盒說明操作，用紫外分光光度計(jì)測量OD值并計(jì)算RNA濃度和質(zhì)量；根據(jù)RNA的量，建立一個(gè)20 μL的反應(yīng)體系，在RT-PCR儀器中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃30 min，80℃ 5 min，4℃冷卻，-20℃保存，在 PCR儀上擴(kuò)增；目的基因擴(kuò)增用ΔΔCT法計(jì)算，A=CT（目的基因，實(shí)驗(yàn)樣本）-CT(內(nèi)標(biāo)基因，實(shí)驗(yàn)樣本)，B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本），K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K，采用β-actin為內(nèi)參，計(jì)算GRP78、PERK、eIF2α 的 CT值。

1.2.7 Western blot法檢測 GRP78、PERK、eIF2α 蛋白的表達(dá) 每組隨機(jī)選取兩只大鼠的腎組織進(jìn)行蛋白提取，檢測蛋白濃度，保證每個(gè)樣品總蛋白量。每個(gè)樣品總蛋白上樣量均為40 μg，進(jìn)行制膠與上樣，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，按300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)整，將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，加入已稀釋好的一抗4℃過夜（兔屬GAPDH，GRP78與5%脫脂牛奶呈 1∶2 000，PERK 與 5%BSA 呈 1∶1 000，eIF2α 與 5%BSA 呈 1∶2 000）用 TBST 洗 3次，每次5 min，加入稀釋好的二抗（HRP-Goat anti Rabbit與5%脫脂牛奶呈 1∶10 000），室溫孵育 30 min，用TBST在室溫?fù)u床上洗4次，每次5 min，暗室中曝光，將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC 4.0軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組大鼠體毛光澤，活動(dòng)敏捷，飲食量、尿量無明顯變化，實(shí)驗(yàn)第8周末，體質(zhì)量均較前增加；大鼠造模成功率為86%（43/50），造模成功后的大鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕，每日飲水量及尿量均多于對照組；造模后第4天可見大鼠皮毛濕黃，活動(dòng)遲緩，多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降，至實(shí)驗(yàn)第8周末，模型組大鼠上述癥狀最明顯，治療組上述情況得到不同程度改善，以高劑量組改善最為明顯。

2.2 生化指標(biāo)的檢測 與對照組相比，模型組大鼠血糖（GLU）、血脂（TG、TC）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及蛋白尿（MAU）均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組的 GLU、TG、TC、BUN、Scr及 MAU均下降（P＜0.01 或 P＜0.05），3個(gè)治療組中，格列齊特組的GLU下降最顯著（P＜0.01），高劑量組BUN、Scr、MAU下降最明顯（P＜0.01），腎功能改善明顯。見表 1、表 2。

表1 各組大鼠GLU、血脂的檢測（x±s）mmol/L

表2 各組大鼠BUN、Scr及MAU的檢測（x±s）

2.3 光鏡及電鏡下腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 光鏡下腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu) 對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠腎組織嚴(yán)重?fù)p傷，可見系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多，腎小球基底膜（GBM）增厚，PAS染色呈強(qiáng)陽性，部分腎小球可見毛細(xì)血管間出現(xiàn)PAS染色陽性的層狀結(jié)節(jié)及節(jié)段性透明樣變性，提示腎小球硬化，腎小管上皮腫脹，腎小管管腔變窄。格列齊特組和低劑量組可見輕度彌漫性系膜區(qū)細(xì)胞增生伴GBM增厚，腎小管無明顯改變。高劑量組腎結(jié)構(gòu)改善明顯，僅見腎小球輕度水腫，無增生性病變，腎小管無明顯改變。見圖1。

2.3.2 電鏡下腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu) 對照組GBM厚度基本均勻適中，足細(xì)胞位于GBM外層，足突結(jié)構(gòu)完整，呈柵欄狀整齊排列。模型組GBM增厚，足細(xì)胞出現(xiàn)空泡改變，裂隙膜減少，足突融合，部分足細(xì)胞從GBM脫落，排列紊亂；腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細(xì)胞核腫脹。格列齊特組和低劑量組病變減輕，GBM輕度增厚，系膜基質(zhì)輕度增多。高劑量組病變改善明顯。見圖2。

2.4 各組 GRP78、PERK、eIF2α的免疫組化結(jié)果 GRP78、PERK、eIF2α在對照組中有少量表達(dá)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，三者主要定位在腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi);模型組的 GRP78、PERK、eIF2α 表達(dá)較對照組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），三者主要定位于腎小管；高劑量組、低劑量組與格列齊特組的GRP78、PERK、eIF2α表達(dá)均明顯低于模型組（P＜0.01），高劑量組相比于格列齊特組表達(dá)更低（P＜0.01或P＜0.05）。見表3及圖3-5。

2.5 各組GRP78、PERK、eIF2α的mRNA表達(dá)情況

GRP78、PERK、eIF2α在正常腎組織中有一定量的表達(dá)，相比于對照組，模型組大鼠GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相比于模型組，3個(gè)治療組的 GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相比于格列齊特組，高劑量組的GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)更低（P＜0.01或 P＜0.05）。見表 4。

2.6 Western blot測 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表達(dá) 相比于對照組，模型組大鼠GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表達(dá)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；相比于模型組，各治療組的GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；相比于格列齊特組，高劑量組的GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)更低（P＜0.01或 P＜0.05），見表 5及圖 6。

3 討論

DN在中醫(yī)學(xué)歸為消渴病下消，基本病機(jī)為“氣血兩虛兼血瘀”。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪味甘溫，可益氣固表，補(bǔ)氣升陽；當(dāng)歸味甘辛溫，可補(bǔ)血生血行血，兩者配伍則陽生陰長，氣旺血生，具有補(bǔ)氣活血之功效，與其病機(jī)契合?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷（IV）可通過下調(diào)PERK-ATF4-CHOP通路發(fā)揮抑制足細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎組織，防治DN的作用[8]。且當(dāng)歸與黃芪配伍，當(dāng)歸可增強(qiáng)黃芪中黃芪甲苷在體內(nèi)的活力，并可使黃芪甲苷達(dá)峰時(shí)間提前1倍[tmax由（4.00±1.54）h 至（2.00±0.95）h]，達(dá)峰濃度提高 1 倍[Cmax由（60±7）μg/L 到（146±27）μg/L]，加速黃芪甲苷發(fā)揮功效的進(jìn)程[9]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可抑制高糖條件下腎小球細(xì)胞膜外基質(zhì)蛋白表達(dá)[10]，下調(diào)多個(gè)靶器官相關(guān)蛋白因子（BMP-7、TGF、HPA 等），具有預(yù)防和治療早期DN的作用[11-13]。

表3 各組GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表達(dá)情況（x±s）

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色結(jié)果（×200）

圖2 各組大鼠腎組織電鏡下觀察結(jié)果(×2 000)

圖3 免疫組化檢測GRP78蛋白表達(dá)結(jié)果(×200)

圖4 免疫組化檢測PERK蛋白表達(dá)結(jié)果(×200)

圖5 免疫組化檢測eIF2α蛋白表達(dá)結(jié)果(×200)

表 4 各組 GRP78、PERK、eIF2α 的 mRNA 表達(dá)（x±s）

表 5 各組 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表達(dá)（x±s）

圖6 Western-blot電泳條帶圖

本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)歸補(bǔ)血湯和格列齊特均可改善DN大鼠的一般情況，降低血糖、血脂，而且在降低尿蛋白，改善腎功能和腎臟結(jié)構(gòu)損害方面，當(dāng)歸補(bǔ)血湯優(yōu)于格列齊特。免疫組化、Western Blot及PCR顯示模型組大鼠GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)明顯高于對照組，表明ERS已經(jīng)激活；當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療組大鼠腎組織中GRP78、PERK、eIF2α的表達(dá)相比于模型組明顯下降，高劑量組下降更明顯。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可抑制PERK通路相關(guān)蛋白，緩解ERS，具有保護(hù)腎組織結(jié)構(gòu)和腎功能作用，且呈濃度依賴性。

當(dāng)反常出現(xiàn)后，當(dāng)自然界以某種方式違反支配常規(guī)科學(xué)所做的預(yù)測后，此時(shí)科學(xué)共同體成員則會(huì)對反常的現(xiàn)象和領(lǐng)域進(jìn)行一定的研究，以便找出問題所在，通過調(diào)整范式來消解這種反常?！鞍l(fā)現(xiàn)始于意識(shí)到反常，即始于認(rèn)識(shí)到自然界總是以某種方法違反支配常規(guī)科學(xué)的范式所做的預(yù)測?！盵2]44由此可見，出現(xiàn)反?，F(xiàn)象后，調(diào)整范式是關(guān)鍵的一步。范式有能力迫使科學(xué)共同體成員去處理這種反常，因此，范式不僅僅是被動(dòng)的被利用的，它也有主動(dòng)的一面?？茖W(xué)共同體依賴于范式的時(shí)候，范式便由被動(dòng)的狀態(tài)變?yōu)橹鲃?dòng)的狀態(tài)，由靜態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床治療DN提供了新的依據(jù)。但仍存在問題需進(jìn)一步探究，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具體作用于PERK通路的機(jī)制尚不明確，推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過抑制PERK通路進(jìn)一步抑制eIF2α下游的ATF4、CHOP、Capase12等凋亡相關(guān)基因緩解ERS造成的損害，是否激活了下游其他分子通路，還需更深入的研究。

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