夏珍珍，陳 檉，李冰韶，王永潔，謝遠(yuǎn)平，林紅梅，吳 清

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

復(fù)方車(chē)前水浸膏組方為車(chē)前子、牽牛子、大腹皮等多味中藥。臨床上將其涂抹于腹部治療惡性腫瘤引起的癌性腹水，臨床使用多年，療效顯著且年需求量逐漸增加。但因浸膏流動(dòng)性過(guò)大，黏著力差，使用不便，患者順應(yīng)性較差，阻礙了該方的進(jìn)一步推廣。凝膠貼膏作為一種新型的經(jīng)皮給藥劑型，因載藥量大，含水量高，刺激性，敏性小，生物相容性好，使用方便等優(yōu)勢(shì)[1-2]，近年來(lái)成為外用制劑研發(fā)的熱點(diǎn)[3-6]。因此，本研究選擇凝膠貼膏為復(fù)方車(chē)前水浸膏的新劑型，在復(fù)方車(chē)前浸膏基礎(chǔ)上,對(duì)復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏處方進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏提供基礎(chǔ)。

1 材料

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A檢測(cè)器(日本島津國(guó)際貿(mào)易有限公司)，JY1002電子天平（上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司），BSA-224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），5DM-03-R萬(wàn)能混合攪拌機(jī)（株式會(huì)社三英制作所），涂布機(jī)（自制）；CZY-G型初黏力測(cè)試儀（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司），CZY-S型持黏力測(cè)試儀（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司），BLD-200N型電子剝離試驗(yàn)機(jī)（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司），TK-24BL型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。

NP700[亞什蘭（中國(guó)）投資有限公司]，甘羥鋁（北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司），L（+）-酒石酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甘油（北京化工廠，分析純），PVPK90（天津市福晨化學(xué)試劑廠），京尼平苷酸（上海源葉，批號(hào)P25F8F30154），圓形透析膜片(截留分子量3.5KD，批號(hào)SP132488，生工生物工程上海股份有限公司)，甲醇（Sigma，色譜純），水（娃哈哈），昆明小鼠[SPF級(jí)，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào) SCXK（京）2016-0002]，Mouse VEGF Elisa Kit（Proteintech）。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠貼膏的制備 通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)[7-8]，確定凝膠貼膏的制備工藝。取一定量NP700、甘羥鋁均勻分散于適量的甘油中，作為A相；將一定量的酒石酸溶解于蒸餾水中，再加入PVPK90，放置過(guò)夜，使PVPK90充分溶脹，作為B相；將B相和一定量的浸膏加入A相中充分?jǐn)嚢瑁坎己笱b入鋁箔袋中，放置成型，即得。

2.2 凝膠貼膏的評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.1 初黏力測(cè)定 參照中國(guó)藥典（2015）[9]。測(cè)量值以小球質(zhì)量計(jì)算，單位：質(zhì)量（g），以測(cè)得最大值為35分，其余的與之相比計(jì)算得分。

2.2.2 持黏力測(cè)定 參照中國(guó)藥典（2015）[9]。測(cè)量值以剝離力計(jì)算，單位：牛頓（N），以測(cè)得最大值為35分，其余的與之相比計(jì)算得分。

2.2.3 剝離強(qiáng)度測(cè)定 參照中國(guó)藥典（2015）[9]。測(cè)量值以掉落時(shí)間計(jì)算，單位：s，以測(cè)得最小值為30分，其余的與之相比計(jì)算得分。

2.2.4 綜合感官評(píng)分[7-8]

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選顯著影響因子 本實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)凝膠膏成型影響較大的因素，為Box-Behnken設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

2.3.1 實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將NP700、PVPK90、甘油、甘羥鋁、酒石酸 5 個(gè)因素作為Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素，因素水平設(shè)計(jì)表，見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman水平設(shè)計(jì) g

2.3.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按“2.2.1/2.2.2/2.2.3”項(xiàng)對(duì)凝膠膏3個(gè)黏性指標(biāo)進(jìn)行考察，綜合得分。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值，見(jiàn)表2。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析，見(jiàn)表3。

表3 Plackett-Burman方差分析表

從表3中可以看出，該模型回歸顯著，模型r2=0.981 3，說(shuō)明回歸擬合程度較好，甘油、PVPK90、NP700具有顯著性，因此選擇NP700、PVPK90、甘油3個(gè)因素作進(jìn)一步響應(yīng)面分析，以確定這些因素的最優(yōu)水平。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)考察顯著因子最佳用量范圍 本節(jié)實(shí)驗(yàn)以綜合感官評(píng)分為指標(biāo)，在Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果基礎(chǔ)上考察顯著因子NP700、PVPK90、甘油的最佳用量范圍。按2.1項(xiàng)下制備凝膠貼膏，按2.2.4項(xiàng)下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終得到PVPK90 4～6 g，NP700 5～8 g，甘油 30～35 g 為 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平。

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)篩選最優(yōu)處方

2.5.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果，利用Design-Expert8.0.6軟件，將對(duì)凝膠膏成型影響較大的NP700、PVPK90、甘油3個(gè)因素及水平設(shè)計(jì)[10]，見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平g

2.5.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照Box-Behnken設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以初黏力、持黏力、180°剝離強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各組實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分結(jié)果，見(jiàn)表5。

2.5.3 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 以Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)處理結(jié)果及方差分析，見(jiàn)表6。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件，以評(píng)價(jià)指標(biāo)分別對(duì)各因素進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，表5所示為不同配方響應(yīng)值的相應(yīng)變化。表6為本實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果，經(jīng)F檢驗(yàn)顯示總模型方程顯著（P=0.000 2），r2=0.968 3，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。由表 6 可知 A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2 有顯著性差異，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型：Y=83.20+13.68A+10.01B+8.21C+15.04AB-10.24AC+5.96BC-5.92A2-32.84B2-12.72C2。式中Y為響應(yīng)值，A，B，C分別為NP-700、PVAK90、甘油。該方程相關(guān)系r2=0.968 3。由表 6 可知，整體模型達(dá)到顯著水平（P＝0．000 2），表示該二次方程模型比較顯著，失擬值=0.286 8＞0.05，沒(méi)有顯著性，變異系數(shù)（CV）為 11.61，其值較小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定可信。由表6可知，模型中A、B、C、AB、AC、B2、C2 項(xiàng)具有顯著性，表明各個(gè)自變量與因變量之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，具有一定的交互作用。在各影響因素中，因素A的影響最大，其次是因素B。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析

由圖1可見(jiàn)中響應(yīng)面的3D曲面圖和等高線圖，直觀地反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值。圖1中A、B，A、C響應(yīng)面曲線較陡，說(shuō)明A與B、A與C之間具有顯著性交互作用，這和方差分析的結(jié)果相一致。

2.5.4 最優(yōu)處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)選得到，在NP 700 8 g、PVPK90 5.38 g、甘油 32.5 g、酒石酸 0.5 g、甘羥鋁 0.5 g的條件下，其最大評(píng)價(jià)總分為95.39。按照最佳處方條件制備了3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)表7。結(jié)果顯示評(píng)價(jià)總分與模擬值基本接近，表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

2.6 京尼平苷酸高效液相色譜（HPLC）方法的建立2.6.1色譜條件色譜柱：InertsilODS-3C18（4．6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇：0.5%醋酸=8∶92；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 取京尼平苷酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.406 mg的對(duì)照品溶液，過(guò)濾，即得。

2.6.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏1.0 g，精密加入40 mL甲醇，稱(chēng)質(zhì)量，加熱回流提取60 min，冷卻到室溫，再稱(chēng)質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.6.4 陰性樣品溶液的制備 按2.6.3項(xiàng)下制備車(chē)前子陰性凝膠貼膏溶液，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.6.5 專(zhuān)屬性、精密度、穩(wěn)定性考察結(jié)果均良好

2.6.6 線性關(guān)系考察 按2.6.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以京尼平苷酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程 Y=993 996X-12 878（r2=0.999 9），表明京尼平苷酸在2.032～203.2 μg/mL內(nèi)與峰面積

圖1 Box-Behnken設(shè)計(jì)3D曲面圖及等高線圖

表7 最佳處方3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

呈良好線性范圍。

2.7 凝膠貼膏中京尼平苷酸的體外釋放研究 采用Franz擴(kuò)散池法[11-12]，上室為擴(kuò)散室，下室為接受室，有效擴(kuò)散面積3.14 cm2。凝膠膏貼于3.5KD圓形透析膜片上，再將透析膜片固定在兩室之間。接收室注滿(mǎn)磷酸鹽緩沖液（PBS），排出氣泡，使液面完全與透析膜片接觸。磁攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為300 r/min，控制溫度（32±0.1）℃，計(jì)時(shí)。于設(shè)定的時(shí)間點(diǎn) 2，4，6，8，10，12，24 h 移取接收液 1mL，同時(shí)補(bǔ)加同樣體積的新鮮接收液，過(guò)濾，測(cè)定接收液中京尼平苷酸的含量，計(jì)算Qn%。

式中Qn%為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積釋放率（%），V為接收室中接收液的體積（mL），Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度（mg/mL），1代表取樣體積1 mL，W為凝膠膏中所含藥物質(zhì)量（mg）。京尼平苷酸24 h釋放率為（81.23±1.52）%。以Qn%對(duì)釋放時(shí)間t作圖，繪制累積釋放曲線，見(jiàn)圖2。

對(duì)釋放數(shù)據(jù)以O(shè)rigin Pro8.0軟件進(jìn)行模型擬合，結(jié)果見(jiàn)表8。

圖2 京尼平苷酸24 h累積釋放率（n=3）

表8 京尼平苷酸的Qn%-t模型擬合

由表8可知，復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏中京尼平苷酸體外釋放零級(jí)擬合和一級(jí)擬合的相關(guān)系數(shù)分別0.903 82、0.991 38，說(shuō)明藥物的釋放過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，即與濃度有關(guān)。

2.8 藥效實(shí)驗(yàn) 健康KM小鼠（SPF級(jí)），適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為模型組、空白組、空白貼膏組、復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏組、臨床浸膏組，每組8只。各組小鼠稱(chēng)質(zhì)量后，腹部剃毛，面積為2 cm×3 cm。除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射接種小鼠H22肝癌細(xì)胞，細(xì)胞接種密度[17-18]為 1×107個(gè)/mL，0.2 mL/只。造模第2天起，除模型組外，各組開(kāi)始給藥，臨床浸膏組涂抹臨床浸膏，涂抹于小鼠腹部，并裹上紗布，以醫(yī)用膠帶固定。復(fù)方車(chē)前凝膠膏剪為2 cm×3 cm大小，貼于小鼠腹部，以醫(yī)用膠帶固定，空白貼膏組小鼠腹部貼空白凝膠膏，空白組以蒸餾水涂抹，給藥8 h后拆除紗布及膠帶，浸膏組以蒸餾水清洗干凈，連續(xù)給藥1周，每日稱(chēng)質(zhì)量并記錄。破腹取腹水記錄體積。摘取脾臟，濾紙吸干表面液體后，稱(chēng)質(zhì)量并記錄。破胸腔，摘取胸腺，以濾紙吸干表面液體后，稱(chēng)質(zhì)量并記錄。腹水以10 000 r/min，10 min離心，取上清。以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腹水中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的濃度。

胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)[19]計(jì)算公式如下：

胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）×10/體質(zhì)量（g）

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)以 SPPS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 浸膏及復(fù)方貼膏對(duì)小鼠H22肝癌腹水的影響（x±s）

由表9結(jié)果可知，與模型組比較，臨床浸膏組和復(fù)方車(chē)前貼膏組的腹水量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），且復(fù)方貼膏組與臨床浸膏組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.363）。模型組小鼠與空白組相比，胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.001），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.001）。臨床浸膏組和復(fù)方車(chē)前貼膏組的胸腺指數(shù)有一定的升高而脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），且貼膏組與浸膏組無(wú)差異（P=0.846）。浸膏組與復(fù)方貼膏組的小鼠腹水中VEGF的含量與模型組相比，顯著降低（P＜0.05），且貼膏組與浸膏組無(wú)差異（P=0.857）。以上各指標(biāo)，空白貼膏組與模型組均無(wú)顯著差異。

藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方車(chē)前水浸膏及復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏均能有效減輕H22小鼠肝癌細(xì)胞引起的小鼠腹水狀況。藥效實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，給藥后，與模型組相比，浸膏組及貼膏組小鼠毛色有光澤，小鼠狀態(tài)較好，模型組小鼠出現(xiàn)脫毛，毛色暗淡等病態(tài)。但浸膏組由于浸膏涂抹，皮毛被污染嚴(yán)重，而貼膏組小鼠皮毛干凈，光澤較好，生存狀態(tài)較佳。因此，復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏劑型改良成功且具有較高的開(kāi)發(fā)意義。

3 討論

3.1 優(yōu)化方法的選擇 Plackett-Burman設(shè)計(jì)能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)篩選并確定對(duì)結(jié)果影響比較顯著的因素，避免在后期的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中由于部分因子不顯著而浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)資源，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、質(zhì)量控制和食品科學(xué)等領(lǐng)域[13]。Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)采用非線性模型擬，通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高中心組合設(shè)計(jì)采用非線性模型擬，通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，對(duì)影響應(yīng)值各因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，所得結(jié)果更加直地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，所得結(jié)果更加直觀，便于分析[14-15]。相比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及均勻設(shè)計(jì)，Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化更適合處方配比復(fù)雜，各因素之間存在交互作用的凝膠貼膏處方設(shè)計(jì)。因此，本研究選擇以Plackett-Burman設(shè)計(jì)選擇顯著因子，以Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化篩選最佳處方。

3.2 小鼠H22肝癌腹水實(shí)驗(yàn) 小鼠（H22）肝癌是最常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一，廣泛應(yīng)用于小鼠腫瘤動(dòng)物模型的復(fù)制[17]。在本研究中，藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H22肝癌腹水模型造模成功后，模型組小鼠與空白組相比，腹部積水嚴(yán)重，出現(xiàn)膨脹，胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.001），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.001）。造模成功后，H22對(duì)小鼠的免疫系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的傷害，胸腺萎縮，脾臟腫脹，引起水循環(huán)障礙，造成腹水不消，臨床浸膏及改變劑型后的復(fù)方車(chē)前凝膠貼膏均能夠有效的降低腹水量，提高胸腺指數(shù)，改善H22對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的傷害。

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